Kitabı oku: «Estudios de la tuberculosis desde la Sucursal del Cielo», sayfa 3

Diagnóstico de TB en personas coinfectadas con el VIH

El diagnóstico de TB en personas coinfectadas con el VIH enfrenta un reto adicional debido a que los pacientes con TB/VIH a menudo desarrollan formas diseminadas de la enfermedad. En consecuencia, las herramientas diagnósticas tradicionales que dependen de muestras de esputo presentan muy baja sensibilidad y especificidad (31). En este grupo de pacientes coinfectados TB/VIH, se ha encontrado una molécula distintiva de la micobacteria: el lipoarabinomanan (LAM) en la orina de los individuos, especialmente en aquellos con infección diseminada. LAM es un lipopolisacárido (o lipoglicano) presente en gran abundancia en la pared celular de M. tuberculosis y se considera un análogo del lipopolisacárido de las bacterias Gram negativas por su potencial endotóxico y sus composición bioquímica. La sensibilidad de la prueba depende del estado de la infección por VIH de los pacientes y su recuento de linfocitos CD4+ (31). Basados en la detección de LAM se han desarrollado varios tipos de ensayos. Clearview TB, es un ensayo inmuno-absorbente ligado a enzima (ELISA) que permite una detección cuantitativa de LAM en orina; se ha demostrado que esta prueba incrementa su sensibilidad cuando la orina se concentra 100 o más veces (32). Alternativamente, una versión simplificada de inmunoensayo de detección de LAM es la prueba Alere Determine™ TB-LAM-Ag. Este es un ensayo de flujo lateral de fácil ejecución, que se puede usar en puntos de atención médica con infraestructura mínima (point of care assay) y que proporciona resultados rápidos (31, 33). La sensibilidad de las pruebas de LAM es baja en pacientes VIH negativos (10% a 20%), pero aumenta en pacientes VIH positivos con un promedio de 56% (33). La sensibilidad de la prueba LAM es aún mayor (66.7%) en pacientes VIH positivos con recuentos de células T CD4 + muy bajos (50 células/µl) (34, 35). En el año 2015, la OMS publicó una política guía donde se recomienda el uso de TB-LAM exclusivamente en pacientes con estados avanzados de HIV (36).

Métodos diagnósticos para detectar la infección tuberculosa latente (ITBL)

La OMS ha definido la ITBL como un estado de respuesta inmunológica constante a la estimulación por antígenos y moléculas de la micobacteria, caracterizado por ausencia de signos y síntomas de la enfermedad activa (37). Para diagnosticar esta forma de TB, en lugar de buscar directamente el microorganismo, la infección o la exposición a M. tuberculosis se evalúa mediante la respuesta inmune del huésped. Una de las pruebas representativas que se fundamenta en la respuesta inmune del paciente, es la prueba intradérmica de tuberculina (también conocida como método de Mantoux o prueba cutánea de PPD). Actualmente, esta prueba representa la mejor herramienta para identificar la infección latente. Curiosamente las bases experimentales para el desarrollo de este test también fueron establecidas por Koch en 1890 (38). Inicialmente, Koch consideró que la inyección de un preparado (inactivado) del cultivo de M. tuberculosis (posteriormente denominado tuberculina) podría ser un tratamiento para la TB a modo de “vacuna”. Poco después, se demostró que era ineficaz para prevenir la enfermedad, sin embargo, la tuberculina generaba en algunas de las personas inoculadas una reacción cutánea, circunstancia que sería aprovechada posteriormente como estrategia diagnóstica (38). Los hallazgos de la exposición a la tuberculina fueron estudiados más a fondo por Von Pirquet quien en 1907 desarrolló la primera prueba cutánea para identificar exposición a M. tuberculosis (39). Con base en los estudios de Von Pirquet, Charles Mantoux propuso la inyección intradérmica de tuberculina (38). Posteriormente, Florence Seibert, en 1934, realizó varios estudios tratando de definir una composición estandarizada de tuberculina, actualmente conocida como derivado de proteína purificada (PPD, nombre con el que también se le conoce a la prueba de tuberculina) (38, 40). La prueba cutánea de la tuberculina (TST, por sus siglas en inglés tuberculin skin test) se fundamenta en una reacción de hipersensibilidad de tipo IV en la que los linfocitos T CD4+, previamente expuestos a antígenos micobacterianos, migran al sitio de inyección de PPD (41). La PPD es actualmente la principal herramienta para identificar individuos con infección latente, desafortunadamente, la vacuna con el Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) y/o la infección con micobacterias no tuberculosas (MNT) pueden llevar a resultados falsos positivos. Entre otras limitaciones de la PPD, está la incapacidad para discriminar entre TB latente y TB activa, y la baja sensibilidad en pacientes con algún nivel de inmunosupresión. En el caso específico de pacientes con coinfección TB/VIH la lectura del test se ve fuertemente afectada por la reducción en la induración característica de un test positivo (40, 42). Alternativamente, los ensayos de liberación de interferón gamma (IGRA, por sus siglas en inglés Interferon-Gamma Release Assays), son específicos para M. tuberculosis y presentan una mayor sensibilidad, siendo la alternativa al PPD para identificar individuos con ITBL coinfectados con VIH (aunque se debe resaltar que con el progreso de la infección por VIH decrece la sensibilidad), niños y mujeres embarazadas. Dos IGRA se utilizan ampliamente en entornos clínicos: la prueba QuantiFERON-TB Gold InTube (QFT-GIT) y la prueba T-SPOT TB (T-Spot). QTF-GIT utiliza una combinación de antígenos de las proteínas micobacterianas ESAT-6, CFP10 y TB7.7. Estos antígenos no están presentes en el BCG ni en la mayoría de las MNT. Para la prueba, la sangre de un individuo se mezcla con los antígenos, en caso de exposición previa a M. tuberculosis se determina con base en la concentración de interferón gamma liberado (43, 44). Por otro lado, la prueba del T-Spot determina la infección por M. tuberculosis en función del número de células que producen interferón gamma utilizando un ensayo de inmunotransferencia ligado a enzimas. T-Spot utiliza los antígenos ESAT-6 y CFP10, por separado (45).

Además de los IGRA, se han desarrollado varias pruebas serológicas para una variedad de proteínas de M. tuberculosis: el antígeno de 38 KDa, HspX, ESAT-6, Ag85 entre otras (46, 47), en este caso dirigidas a la identificación de pacientes con TB activa. Sin embargo, la mayoría de estas pruebas han mostrado un rendimiento deficiente en el diagnóstico de TB con sensibilidades que van del 0,97% al 59% comparado con el cultivo. Consecuentemente, en 2011, la OMS declaró que los datos asociados con la evaluación de las pruebas serológicas para TB eran de baja calidad y que la cantidad de resultados falsos positivos y falsos negativos estaba impactando adversamente al paciente. Razón por la cual, la OMS recomendó que los clínicos no utilicen este tipo pruebas en la rutina de diagnóstico de TB, entretanto no se genere nueva evidencia (48). En general, aparte de IGRA, la mayoría de las pruebas de diagnóstico desarrolladas para probar muestras diferentes al esputo (por ejemplo: suero u orina) se han centrado en la detección de biomoléculas de la micobacteria incluyendo proteínas, lipoglicanos y/o, como ya se mencionó antes, ácidos nucleicos. La evaluación combinada de marcadores derivados del huésped con los derivados de la bacteria podría aumentar la capacidad para el diagnóstico de TB y la identificación de diferentes etapas de evolución de TB entre infección y enfermedad activa.

TB en cifras y retos diagnósticos actuales

Según la OMS, alrededor de 7 millones de casos de TB pulmonar fueron notificados en 2018 por los programas nacionales de TB en todo el mundo, sobre un total de 10 millones de casos estimados. Se evidencia una brecha de notificación del 30% (14). Una brecha adicional del 45% fue observada entre los casos notificados y los que se confirmaron microbiológicamente (14). Es importante resaltar que la brecha entre los casos estimados y el número de casos notificados se ha mantenido constante desde el primer reporte de TB de la OMS en 1997. Dos razones principalmente podrían explicar esta brecha: 1) la falta de sistemas de información eficientes, especialmente en los países con mayor carga de TB; y 2) la falta de herramientas de diagnóstico más accesibles (limitaciones para acceder a los sistemas de salud), sensibles y precisas. La microscopía y el cultivo de muestras de esputo siguen siendo las dos herramientas más importantes para la confirmación bacteriológica de TB pulmonar, de hecho, la mayoría de los 3 millones de casos de TB que se confirmaron en 2018 fue únicamente con microscopía (14).

Otro componente importante que contribuye a la epidemia de TB es la gran proporción de casos de ITBL. Una reciente reevaluación del estimado de personas con ITBL en el mundo, mostró que aproximadamente el 25% de la población global tiene infección latente y se estima que del 5% al 10% desarrollará enfermedad activa en el transcurso de su vida (49, 50). El riesgo de progreso de ITBL a infección TB activa incrementa 10% cada año en personas que se coinfectan con el VIH (51). Desafortunadamente, las dos estrategias disponibles para la identificación de ITBL, TST e IGRA, son ensayos inmunológicos dependientes de células T y la inmunosupresión afecta gravemente su sensibilidad; lo que hace que sean insuficientes o poco efectivas para detectar la ITBL en pacientes con estados avanzados de infección por VIH. De hecho, a medida que disminuye el recuento de células CD4 +, disminuye la efectividad de IGRA (52). Dos grandes retos diagnósticos permanecen como prioridad para mejorar el control de la TB a nivel mundial: 1) No existe ninguna prueba que permita discriminar la TB activa de ITBL; y 2) no hay ninguna prueba que permita identificar personas con infección latente que se encuentren en proceso de desarrollar enfermedad activa.

Biomarcadores de TB de muestras diferentes al esputo: la clave para nuevos desarrollos diagnósticos

Como se ha mencionado hasta ahora la mayoría de los enfoques para el diagnóstico de TB, depende de la visualización microscópica, el cultivo o la detección de ácidos nucleicos de M. tuberculosis. Además, la mayoría de las pruebas emplean muestras de esputo, donde usualmente se concentran las bacterias, particularmente en aquellos casos donde la presentación clínica es pulmonar (presentación clínica más frecuente de TB). Sin embargo, es importante tener en cuenta que depender de muestras de esputo para el diagnóstico tiene desventajas. Entre las más relevantes se sabe que obtener muestras de esputo de niños menores de cinco años es prácticamente imposible (53). Asimismo, los pacientes con TB coinfectados con el VIH normalmente tienen una carga bacteriana muy baja en su esputo (TB paucibacilar) (54).

La detección de moléculas de M. tuberculosis(proteína, lípido, ácido nucleico) en una muestra biológica derivada de paciente con indicios clínicos de padecer TB, es el punto de inicio para diagnosticar la enfermedad en el laboratorio. De la misma manera, los marcadores inmunológicos inequívocamente vinculados a la infección por M. tuberculosis también se pueden utilizar para fines de diagnóstico. En conjunto, los marcadores biológicos que permiten identificar a los pacientes que se encuentran en un proceso patológico se denominan biomarcadores de diagnóstico (55). En el caso de TB la identificación de biomarcadores diagnósticos debe considerar los múltiples procesos asociados a la infección. Una aproximación simplista del “ciclo de vida” de M. tuberculosis, sugiere que la infección inicial se establece mediante la inhalación de aerosoles cargados con bacterias generados por pacientes con TB pulmonar activa al expectorar o toser (56). Se plantea la hipótesis de que existe un número muy reducido de personas que pueden eliminar la micobacteria vía respuesta inmune innata, en cuyo caso las TST e IGRA serán negativas. Otro grupo de individuos controla la infección y elimina la micobacteria mediante la respuesta inmune adaptativa lo que resulta en TST que puede ser negativo o positivo e IGRA positivo (56, 57). En un tercer grupo de individuos M. tuberculosis invade los macrófagos alveolares usualmente en la parte inferior del pulmón, estableciendo una infección intracelular que al ser completamente contenida (pero no eliminada) por la respuesta inmune (90% a 95% de los pacientes) conduce a la ITBL. El individuo puede mantener el estado latente de infección durante décadas. Sin embargo, una persona con ITBL puede progresar a TB activa con el potencial de propagar las micobacterias, mediante la generación de aerosoles al toser y/o expectorar (56, 57). Una cuarta posibilidad ocurre cuando, después del establecimiento de la infección intracelular, el sistema inmunitario del paciente no puede controlar la bacteria y el paciente desarrolla TB activa (5% al 10%). Después de recibir tratamiento, los pacientes con TB activa pueden convertirse en casos de ITBL u obtener una esterilización completa (58). Ninguno de los estados durante la infección por M. tuberculosis encaja en una clasificación dicotómica perfecta. Por el contrario, la transición de ITBL a enfermedad activa y de TB activa a curación definitiva o ITBL nuevamente (después del tratamiento), es un continuo de etapas (58). Para mejorar el control de la TB, es importante descubrir biomarcadores de diagnóstico para cada una de las diferentes etapas del continuo de la infección con la micobacteria (Figura 1).

Figura 1. Biomarcadores para diagnóstico de tuberculosis. Para controlar efectivamente la TB, es necesario el descubrimiento de nuevos biomarcadores de diagnóstico no solo para la enfermedad activa, sino también para la identificación de la infección de TB latente y reactivación. Fuentes: (14), ǂ (49).

Fuente: Elaboración propia

Identificación de biomarcadores para TB activa y latente

En el contexto de las enfermedades infecciosas, los biomarcadores pueden ser derivados de patógenos, así como, derivados del huésped. Además de los biomarcadores ya mencionados que han jugado un papel importante en la detección de la infección por M. tuberculosis (el ADN micobacteriano encontrado en cualquier cavidad infectada y LAM en la orina), varios estudios han probado las biomoléculas micobacterianas como marcadores potenciales de enfermedad activa o infección latente. Las micoliltransferasas de unión a fibronectina comúnmente conocida como antígeno 85 (Ag85) se han encontrado formando complejos inmunes con inmunoglobulinas y fibronectina en plasma de pacientes con TB (59). Sorprendentemente, no hay estudios recientes que prueben la presencia de Ag85 en la sangre de pacientes con TB activa, excepto en un estudio reciente realizado por Kruh-Garcia y colaboradores (60) abriendo una luz para una posible prueba diagnóstica no dependiente de esputo. Desde el lado del huésped, Sartain y colaboradores, propusieron una versión mejorada de un ensayo serológico para discriminar diferentes etapas de la TB activa. En su estudio Sartain desarrolló un ensayo de micro matrices de proteínas para la detección simultánea de reactividad serológica frente a varias proteínas de M. tuberculosis. En esta estrategia, generaron una biblioteca de 960 fracciones simples de citosol y proteínas secretadas de M. tuberculosis, que se analizaron con muestras de sueros de cinco grupos heterogéneos de pacientes: pacientes sin signos y síntomas de TB activa con PPD positiva (como casos de ITBL), TB cavitaria (una forma avanzada de TB activa caracterizada por la presencia de uno o más granulomas abiertos del que se expulsó el centro necrótico a través del árbol bronquial (61)), TB no cavitaria, coinfección VIH/TB y pacientes VIH+/TB negativos. Se encontraron cuatro antígenos micobacterianos asociados exclusivamente con la TB cavitaria (Psts1, HspX, Mpt64 y TrxC) y once antígenos (incluidos SodC y BfrB) que generaron la respuesta más fuerte en la TB cavitaria y no cavitaria (62); estos estudios experimentales sugieren una posible aplicación de la detección de anticuerpos frente a múltiples antígenos de M. tuberculosis, en el diagnóstico de TB que debe ser confirmada en estudios subsecuentes.

Un enfoque diferente basado en el suero para identificar TB activa o ITBL se basa en la caracterización de microARNs humanos circulantes (63, 64). Un estudio, mostró que 59 microARNs (incluidos miR93 * y miR29a) estaban sobre expresados en pacientes con TB activa. Una evaluación adicional demostró que miR29a presentaba un alto potencial diagnóstico que debería ser validado con estudios complementarios (65).

En el contexto de los biomarcadores de diagnóstico derivados del huésped, se encontró que la proteína amiloide A y la trastirretina (prealbúmina) en suero, mostraron una precisión diagnóstica para TB activa que osciló entre el 78% y el 90%, utilizando ensayos complejos que acoplaban tecnología de microarrays, un tipo especial de espectrometría de masas (absorción/ionización laser en superficie con espectrometría de masas (SELDI-MS)) e inmunoensayos (66). Otro estudio comparó pacientes con TB tanto VIH+ como VIH- con individuos con ITBL y con pacientes que presentaban otras enfermedades respiratorias (OER) y voluntarios sin TB. Inicialmente, a través de ensayos de proteómica identificaron 165 proteínas expresadas diferencialmente en pacientes con TB (VIH-) en comparación con ITBL. Con el fin de disminuir la interferencia generada por las proteínas que se aumentan en fase aguda eliminaron del análisis aquellas que se sabe que forman parte de la respuesta de fase aguda en diversas enfermedades infecciosas. El análisis final mostró que diez proteínas podían discriminar TB/VIH- y de OER, mientras que ocho proteínas discriminaban TB/HIV+ de OER. CD14 y la glicoproteína extracelular SEPP1 fueron comunes en ambos grupos (67).

Uso de ciencias “ómicas” en el descubrimiento de biomarcadores de TB

Uno de los campos más recientes para el descubrimiento de nuevos biomarcadores es la identificación y cuantificación de moléculas pequeñas (<1.5 KDa) involucradas en todas las etapas de la función celular, en una aproximación experimental y metodológica conocido como metabolómica (68). Los metabolitos del patógeno y del huésped se han estudiado como biomarcadores potenciales de TB. Con respecto a los metabolitos de M. tuberculosis, varios autores han utilizado el cultivo in vitro para la identificación inicial de candidatos teniendo en cuenta las dificultades asociadas con la interferencia de la matriz del huésped (suero o plasma). Un metabolito con gran potencial es el ácido tuberculostearico (TBSA), el cual se ha identificado en diferentes muestras de pacientes con TB activa (69). Desafortunadamente, TBSA mostró una sensibilidad y especificidad bajas (54% y 80%, respectivamente) y un alto costo para su detección (69, 70). Finalmente, los lípidos de la pared celular (específicamente los ácidos micólicos) están bajo intensa investigación en este campo. La presencia/ausencia de diferentes clases de ácidos micólicos ha demostrado potencial para discriminar entre M. tuberculosis y otro grupo importante de MNT clínicamente relevantes (Sistema de Identificación de Micobacterias MYCOLCS) (68, 71). Con respecto a los metabolitos derivados del huésped, los metabolitos del plasma mostraron una capacidad prometedora para discriminar a los pacientes con TB activa de pacientes con neumonía y de voluntarios sanos. Específicamente, la presencia de ceramida mostró una sensibilidad y especificidad superiores al 85% para el diagnóstico de TB (72). Un estudio comparó los metabolitos séricos de pacientes con TB y los controles sanos, mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), encontrando que trece metabolitos aumentaron significativamente y cuatro disminuyeron en el grupo de pacientes con TB. Según este arreglo de metabolitos, el proceso más afectado durante la infección por M. tuberculosis fue la biosíntesis de proteínas (73). Otro método con el cual se consiguió un alto grado de caracterización para detectar metabolitos potencialmente biomarcadores de diagnóstico de TB, consistió en el desarrollo de una “nariz electrónica” capaz de distinguir las especies de micobacterias en entornos de laboratorio; sin embargo, la prueba mostró una sensibilidad (75%) y especificidad (67%) bajas en entornos clínicos (68). Uno de los principales desafíos de los estudios de metabolómica en el campo del diagnóstico de la TB es su aplicación en campo debido al uso de tecnologías complejas y costosas.

Diversos enfoques proteómicos se han utilizado para encontrar biomarcadores de TB en suero/plasma y otras muestras alternativas al esputo (74). La concentración de proteínas en diferentes fluidos corporales puede reflejar procesos patológicos. Varias proteínas se usan actualmente como marcadores de condiciones normales o de enfermedad en entornos clínicos de rutina: albúmina, hemoglobina, transaminasas hepáticas, entre otras. Estas proteínas normalmente están presentes en gran abundancia en el plasma humano, lo que ha permitido el desarrollo de ensayos de detección simples, de bajo costo y alto rendimiento (ELISA, reacciones colorimétricas, de química seca, etc.) (79). Muchas proteínas involucradas en los procesos celulares pueden circular en el torrente sanguíneo, por lo tanto, el estudio del proteoma plasmático (o del suero) puede reflejar condiciones de enfermedad clínicamente relevantes (75). La espectrometría de masas representa una herramienta robusta para el análisis del proteoma plasmático, generando “firmas biológicas” (matrices de proteínas/péptidos) asociadas a un estado particular de enfermedad. Lamentablemente, debido al rango dinámico extremadamente amplio de concentración de proteínas en el plasma (o suero) humano (> 10 órdenes de magnitud) la identificación de proteínas poco abundantes es un desafío importante (76). En 2014, Kruh-Garcia y colaboradores, utilizando una aproximación proteómica identificaron varias proteínas micobacterianas en suero de pacientes con TB (con y sin coinfección por VIH): Ag85b, Ag85c, Mpt32 (Apa), BfrB, GlcB, HspX, KatG y Mpt64. En estos experimentos, la identificación de las proteínas de M. tuberculosis en suero no se vio afectada significativamente por el estatus VIH del paciente. En dicho estudio, se utilizó inicialmente proteómica tipo shotgun para seleccionar 76 péptidos correspondientes a 33 proteínas candidatas. Posteriormente, se identificaron 29 péptidos correspondientes a 17 proteínas mediante el ensayo de Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM) en pacientes con TB positivo (60). Posteriormente, el mismo grupo de investigadores utilizando metodologías similares, identificaron 35/40 pacientes con TB activa, según la presencia de al menos un péptido micobacteriano. Al comparar muestras de pacientes con TB activa positivo con aquellas provenientes de individuos sanos, cuatro péptidos de las proteínas, Cfp2, Mpt32, Mpt64 y BfrB de M. tuberculosis se asociaron significativamente con los pacientes con TB (77). Los dos últimos estudios utilizaron una fracción única de muestras de sueros enriquecidas con nano vesículas secretadas por las células humanas conocidas como exosomas. El uso de exosomas no solo ayudó con la eliminación de la mayoría de las proteínas séricas humanas, sino que también facilitó la concentración de las proteínas bacterianas (60, 77).