Kitabı oku: «Enfoque clínico y de pruebas diagnósticas en parasitología»

CAPÍTULO 1
TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA LA DETECCIÓN DE PARÁSITOS INTESTINALES
GEOHELMINTIASIS

Las geohelmintiasis son un problema importante de salud pública en los países en vía de desarrollo, donde afectan con mayor frecuencia a población infantil, mujeres embarazadas y adultos jóvenes; esta parasitosis se asocia a la ocurrencia de casos de anemia, desnutrición crónica y mal desempeño escolar en las poblaciones afectadas. En Colombia, las geohelmintiasis se reportan en zonas urbanas marginadas y áreas rurales pobres. Las políticas de control implican la articulación de varias estrategias como quimioterapia, educación, saneamiento básico y participación comunitaria (1,2).

Las manifestaciones clínicas de las geohelmintiasis son inespecíficas, por lo cual el diagnóstico por pruebas de laboratorio es la única herramienta para confirmar la etiología de la patología. Entre las técnicas disponibles, el método de diagnóstico más simple es el examen coprológico o estudio de materia fecal; otras técnicas más complejas incluyen métodos de inmunodiagnóstico (1,2).

Examen directo en materia fecal

El objetivo de la técnica es identificar las formas parasitarias en materia fecal. Estos montajes pueden llevarse a cabo en solución salina o lugol, como lo han descrito diversos autores (3-6).

Recolección de la muestra

La recolección de la muestra de materia fecal se hace directamente del paciente y nunca desde el suelo ni de la taza sanitaria; los recipientes que se utilizan en la recolección deben estar limpios y facilitar el transporte seguro de la muestra. Para garantizar la preservación de los parásitos, se debe evitar el contacto de la muestra con la orina (7).

Examen directo en solución salina fisiológica

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: un portaobjetos, un cubreobjetos y solución salina al 0.85 % (ver anexo 1) (8,9).

Procedimiento

1. Colocar una gota de solución salina sobre un portaobjetos.

2. Tomar una pequeña cantidad de materia fecal de diferentes partes de la muestra con el extremo de un aplicador.

3. Homogenizar la materia fecal tomada con la gota de solución salina.

4. Cubrir con un cubreobjetos y observar al microscopio con los objetivos 10X y 40X.

5. La utilidad de este examen radica en la posibilidad de observar diferentes formas parasitarias tanto de helmintos como de protozoarios (huevos, larvas, quistes, ooquistes o trofozoítos).

Examen directo en solución de yodo o lugol

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: un portaobjetos, un cubreobjetos y lugol (ver anexo 2) (8,9).

Procedimiento

Seguir los pasos descritos para el examen en solución salina fisiológica, pero emplear solución yodada o lugol en lugar de la solución salina. Con esta técnica se visualizan estructuras de larvas, huevos, quistes y ooquistes.

Exámenes por concentración

Estos exámenes se realizan para agrupar las larvas o los huevos de la muestra en aproximadamente un gramo de materia fecal. Gracias a los métodos de concentración y siguiendo los parámetros establecidos por la Organización Panamericana de la Salud (OPS), se pueden clasificar las intensidades parasitarias en una población (8-10).

Método de concentración de formol-éter o método de Ritchie

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: vasos desechables, aplicadores, bajalenguas, gasas, tubos de centrífuga, portaobjetos, cubreobjetos, formol al 10 % (ver anexo 3), éter etílico, solución salina al 0.85 % (ver anexo 1) y lugol (ver anexo 2).

Procedimiento

1. Tomar aproximadamente 1 g de materia fecal con un bajalenguas y colocar la muestra en un vaso desechable.

2. Agregar 10 ml de formol al 10 % y homogenizar.

3. Filtrar a través de gasa doble en un tubo de centrífuga.

4. Agregar 1 ml de éter etílico y mezclar con vigor durante 1 minuto.

5. Centrifugar a 800 g durante 5 minutos.

6. Eliminar el sobrenadante.

7. Mezclar el sedimento con un aplicador y realizar el montaje en solución salina al 0.85 % y en solución de lugol como se describió en el aparte que referencia el examen directo en materia fecal.

Con este método, aumenta la probabilidad de encontrar huevos y larvas en las muestras.

Técnica de Ritchie-Frick modificado

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son los mismos que se utilizaron en el método de concentración de formol-éter, además de solución alcohólica (ver anexo 4) (11,3).

Procedimiento

La detección de helmintos a través del examen coprológico ha sido ampliamente utilizada y ha sido exitosa en el diagnóstico a nivel individual.

1. Mezclar 2 g de materia fecal y 15 ml de formol al 10 % en un frasco.

2. Homogenizar y mezclar por agitación.

3. Filtrar a través de dos capas de gasa en tubo de centrífuga.

4. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos.

5. Anotar el volumen del sedimento y descartar el sobrenadante.

6. Multiplicar el volumen del sedimento por 7, agregar este volumen de solución alcohólica y mezclar.

7. Colocar 50 µl de la suspensión en un portaobjetos, colocar el cubreobjetos y observar al microscopio.

8. Realizar los recuentos de los huevos y larvas. Calcular el promedio y multiplicar el valor por 160. En cada caso, el resultado corresponde al número de huevos o larvas por cada mililitro de heces filtradas y sedimentadas.

Método de Kato-Katz

El Kato-Katz es un método que determina la intensidad parasitaria causada por nemátodos calculada según el número de huevos por gramo de materia fecal (h.p.g.). Este es el método recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS), con el fin de precisar la intensidad parasitaria a nivel individual y en estudios epidemiológicos. La tabla 1.1 muestra la clasificación de las intensidades de infección por diferentes helmintos según el conteo de huevos (3,4,12).

Tabla 1.1. Clasificación de las intensidades de infección por diferentes helmintos según el conteo de huevos.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tiras de papel celofán hidrofílico 25 mm x 30 mm de 40 µm-50 µm de espesor, portaobjetos, placa de plástico de 3 cm x 4 cm con un orificio central de 6 mm de diámetro, 1.37 mm de profundidad y capacidad de 50 mg de materia fecal, espátula de plástico pequeña, papel craft o periódico, tela de nylon con 105 perforaciones por milímetro cuadrado, verde de malaquita al 3 % (ver anexo 5), glicerina, agua destilada, guantes, pinzas y marcadores.

Procedimiento

La figura 1.1 esquematiza el procedimiento de la realización de la técnica Kato-Katz.

Figura 1.1. Procedimiento para la realización de la técnica de Kato-Katz.

Fuente: cortesía de Juan Edwin Villalobos Ospina.

1. Mezclar la glicerina y el verde de malaquita y colocar el papel de celofán en esta solución durante 24 horas antes de hacer los montajes de la muestra de materia fecal.

2. Colocar una pequeña muestra de materia fecal sobre papel craft o sobre papel periódico.

3. Colocar la tira de nylon sobre la materia fecal y presionar.

4. Colocar la placa de plástico sobre un portaobjetos.

5. Recolectar la materia fecal de la malla usando la espátula plástica y rellenar el orificio.

6. Retirar con cuidado la placa, dejando la materia fecal sobre el portaobjetos.

7. Colocar el papel celofán húmedo sobre la materia fecal como si fuera una laminilla e invertir el portaobjetos sobre un pedazo de papel craft, comprimiendo con suavidad.

8. Observar al microscopio después de 1 o 2 horas. Los huevos de Uncinarias spp. se vuelven transparentes, por lo que se dificulta su identificación. El recuento microscópico se realiza por toda la superficie de la tira de papel celofán. El resultado del recuento de huevos de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y Uncinarias spp. se multiplica por 24, que corresponde a h.p.g. Si se visualizan o investigan otros parásitos como Enterobius vermicularis, Strongyloides stercoralis o Taenia spp., se informan resultados cualitativos (positivo o negativo).

Método de agar para Strongyloides

La técnica se basa en el desplazamiento de las larvas de Strongyloides en agar nutritivo, formando canales que se pueden identificar macroscópicamente (14,15).

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: agar (ver anexo 6), cajas de Petri, formol al 10 % (ver anexo 3), gradilla, bajalenguas, marcadores, papel Parafilm® y centrífuga.

Procedimiento

1. Marcar la caja de Petri.

2. Colocar 2 g de materia fecal en el centro de la caja de Petri con el agar.

3. Sellar la caja con papel Parafilm®.

4. Dejar la caja a una temperatura entre 25 °C y 33 °C durante 48 horas.

5. Observar a simple vista o al microscopio.

6. Reportar si se observan canales en el agar.

7. Agregar 10 ml de formol al 10 % y lavar la superficie del agar.

8. Recolectar la suspensión en un tubo y centrifugar a 500 g por 5 minutos.

9. Realizar un montaje directo en solución salina y lugol.

10. Observar al microscopio y reportar los parásitos observados.

Método de Harada-Mori

El fundamento de la técnica es favorecer la embrionación de huevos y la separación de larvas de nemátodos sobre papel de filtro; cuando hay tremátodos y céstodos, se pueden observar los huevos embrionados (16).

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubos de ensayo de 16 mm x 15 mm, papel de filtro de 14 cm de largo y 1 cm de ancho, agua destilada estéril, formol al 10 % (ver anexo 3), gradilla, bajalenguas, marcadores, incubadora y centrífuga.

Procedimiento

1. Homogenizar 2 g de materia fecal con 0.5 ml de agua destilada estéril.

2. Con el bajalenguas, esparcir la materia fecal homogenizada sobre los 10 cm centrales de la tira de papel de filtro. Dejar libres 2 cm en cada extremo del papel de filtro.

3. Introducir la tira de papel sembrada en un tubo previamente marcado, que contiene 5 ml de agua destilada estéril; evitar que la zona con la muestra tenga contacto con el agua.

4. Cerrar el tubo y colocarlo en una gradilla.

5. Incubar a 20 °C durante 72 horas.

6. Descartar la tira de papel filtro y agregar 0.5 ml de formol al 10 %.

7. Centrifugar a 500 g por 5 minutos.

8. Realizar un montaje directo en solución salina y lugol.

9. Examinar al microscopio y reportar los parásitos observados.

Diagnóstico de Toxocara canis

El propósito de este aparte es sugerir diferentes metodologías, basadas en fundamentos distintos para realizar el diagnóstico de toxocariasis.

Ensayo inmunoenzimático

La técnica de ensayo inmunoenzemático (ELISA, por su sigla en inglés) permite determinar la concentración del antígeno o del anticuerpo mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el otro en solución; el complejo antígeno-anticuerpo se detecta a través de una enzima que reacciona con su sustrato. Las enzimas más utilizadas son fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa y beta-D-galactosidasa. La reacción enzimática se detiene en la fase lineal de la curva con la incorporación de ácidos o bases fuertes, según el tipo de sustrato. La cantidad de producto formado en la reacción se mide en un espectofotómetro, al leer la densidad óptica a la longitud de onda, en la cual el color generado tiene su máxima absorción (17-23).

En Colombia, esta técnica se usa con mayor frecuencia para la búsqueda de anticuerpos. En este caso, el antígeno se fija a la fase sólida y luego se agrega la muestra en la que se sospecha que se encuentra el anticuerpo específico. A continuación, se agrega otro anticuerpo dirigido contra el anticuerpo específico de interés; este segundo anticuerpo está unido o conjugado a la enzima. Finalmente, el sustrato de la enzima se incorpora en la placa, con lo que se produce una reacción colorimétrica que se cuantifica con espectrofotómetro. Durante el proceso de estandarización de la prueba de ELISA, se establece el punto de corte que sirve de referencia para determinar si la muestra analizada es positiva o negativa (17-23).

Obtención de parásitos adultos de Toxocara canis y embrionación de los huevos

La obtención de parásitos adultos y la embrionación de los huevos de Toxocara canis son un procedimiento importante en la producción del antígeno secretor/ excretor usado en la técnica ELISA para la detección de anticuerpos (23). Para la obtención de los adultos de T. canis, se sugiere elegir alguna de las siguientes opciones y llevarla a cabo:

1. Entrar en contacto con centros veterinarios que realicen diagnóstico parasitológico y puedan proporcionar los especímenes una vez los caninos hayan sido sometidos a tratamiento antihelmíntico.

2. Entrar en contacto con centros de zoonosis, a fin de que proporcionen los parasitos adultos de T. canis postratamiento o por procedimientos de necropsia.

3. Infectar caninos experimentalmente con huevos de T. canis bajo condiciones de bioterio y obtener los adultos por procedimientos estandarizados y reglamentados en los protocolos de bioética y bienestar animal establecidos en la normatividad nacional e internacional.

Todos estos procedimientos deben ser realizados por profesionales debida mente capacitados y certificados.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: jeringas de 5 ml con su respectiva agua, equipo de disección —es decir, tijeras, pinzas, cuerda o sedade cirugía, etc.–, gasa, papel craft, toallas absorbentes desechables, bolsas para disposición de desechos biológicos, cajas de Petri, guantes quirúrgicos, tapabocas, estereoscopio, jabón antiséptico, microscopio, centrífuga, fiolas de 125 ml, baño serológico a 28 °C, incubadora a 37 °C, termómetro, vasos de precipitado, Tranquilan®, solución de eutanasia (ver anexo 7) y pepsina ácida (ver anexo 8).

Procedimiento

1. Una vez obtenidos los parásitos adultos, colocarlos en solución salina al 0.85 % en un vaso de precipitado.

2. Luego de colectar todos los parásitos, lavarlos con agua corriente varias veces para dejarlos libres de desechos.

3. Colocar los parásitos de nuevo en solución salina al 0.85 % y seleccionar las hembras con ayuda del estereoscopio. Las hembras se caracterizan por ser de mayor longitud y presentar el extremo posterior romo; los machos son más cortos y el extremo posterior termina en una espícula que les confiere una forma puntiaguda.

4. Desechar los machos en bolsas para disposición de desechos biológicos y extraer los úteros grávidos de las hembras. Para ello, asegurar cada hembra con una pinza, cortar ambos extremos del parásito y, con ayuda de otra pinza, hacer presión a lo largo del cuerpo hasta extraer el contenido completo. Depositar los úteros en una solución de pepsina ácida al 1 %.

5. Dejar el material obtenido en agitación magnética a 37 °C por 2 horas.

6. Realizar tres lavados con agua destilada en tubos de centrífuga (aproximadamente 1:10) durante 5 minutos a 100 g.

7. Preparar una solución de formalina al 1 % en fiolas de 125 ml.

8. Mezclar 50 ml de esta solución y 1 ml (aproximadamente) del sedimento obtenido.

9. Dejar las fiolas en incubación a 28 °C por 28 días en presencia de luz (día y noche) y con agitación ligera (cada 24 horas). La embrionación debe controlarse de manera microscópica a partir del día 20; cuando el 80 % de los huevos esté embrionado, la muestra estará lista para ser administrada a animales o para continuar con el procedimiento de obtención de larvas y del antígeno secretorio/excretorio.

Descortezamiento de los huevos y obtención de larvas II de Toxocara canis Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: vasos de precipitado, probetas, balanza, agitador magnético, incubadora a 37 °C, microscopio, portaobjetos, cubreobjetos, guantes, tubos plásticos para centrífuga, solución descortezadora (ver anexo 9), solución equilibrada de Hanks (ver anexo 10), medio de cultivo de larvas de Toxocara canis, pipetas automáticas y puntas, papel indicador de pH y campana de CO2.

Materiales y reactivos estériles

Los materiales y reactivos estériles necesarios para este método son: fiolas, frascos, probetas, gasas, tubos de tapa rosca, medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle (DME, por su sigla en inglés) (ver anexo 11), microscopio invertido y pipetas Pasteur.

Procedimiento

1. Lavar los huevos de Toxocara canis con solución salina al 0.85 % tres veces durante 3 minutos a 500 g. Repetir los tres lavados con agua desionizada.

2. Medir la cantidad de sedimento remanente (±5 ml).

3. Preparar la solución descortezadora.

4. Colocar la suspensión obtenida en agitación suave a 37 °C por 2 horas. Revisar el proceso al microscopio cada 30 minutos.

5. Centrifugar para eliminar la solución descortezadora.

6. Lavar con agua destilada estéril de 5 a 10 veces, centrifugando a 800 g por 5 minutos. Realizar el último lavado con solución equilibrada de Hanks en centrífuga refrigerada a 850 g.

7. Recolectar el sedimento en un tubo, realizar el recuento y hacer los cálculos respectivos:

Ejemplo:

2 ml→160 larvas

X→10 000 larvas

X = 125 ml de solución equilibrada de Hanks. Adicionar 200 ml

de solución equilibrada de Hanks para compensar las pérdidas.

10 000 larvas → Aproximadamente 5 ml de medio DME.

8.Agregar 200 larvas por tubo. Teniendo en cuenta las pérdidas, pueden obtenerse 17 tubos y 2 controles de medio.

9.Incubar los tubos a 37 °C en atmósfera de CO2 al 10 % y de medio de DME.

Preparación del medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle para mantenimiento de larvas II de Toxocara canis

1. Preparar 1000 ml de medio con H2O destilada estéril.

2. Retirar una alícuota de 100 ml con NaHCO3 y medir el pH.

3. La solución de bicarbonato es una solución volátil y es estable por 1 mes si se guarda en condiciones apropiadas (tubos de tapa rosca a 4 °C; pH 7.0±0.2).

4. Adicionar penicilina (1000 UI/ml) y estreptomicina (250 mg/ml).

5. Mantener el medio restante en refrigeración.

6. Servir 5 ml de medio en cada tubo tapa rosca.

7. Agregar las larvas a cada tubo (10 000):200, dejando 2 tubos como controles.

8. Incubar a 37 °C en atmósfera de CO2 al 10 %.

9. Verificar cada 3 días la movilidad de las larvas agitando el medio y observando en el microscopio invertido. Recoger el sobrenadante (3 ml aproximadamente) cada 7 días.

10. Agitar de nuevo el día previo a la obtención del antígeno excretorio/secretorio.

11. Reponer el volumen con medio DME fresco (3 ml).

Diagnóstico serológico para detección de anticuerpos tipo IgG anti Toxocara canis mediante ensayo inmunoenzimático

A continuación, se presentan las condiciones experimentales necesarias para llevar a cabo el diagnóstico serológico para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-Toxocara canis.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: placas de poliestireno 96 pozos Immulon I, papel secante, nevera, cronómetro, micropipetas automáticas y puntas, frasco lavador, solución reguladora de revestimiento 0.05 M pH 9.6 (ver anexo 12), solución reguladora de fosfato (PBS, por su sigla en inglés) 0.15 M pH 7.4 (10X) (ver anexo 13), PBS 0.15 M pH 7.4 más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14), solución reguladora de dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15), paranitrofenilfosfato e hidróxido de sodio 3N (ver anexo 16).

Condiciones de trabajo utilizadas en Colombia Antígeno secretorio/excretorio

Preparar a partir de cultivos de larvas de Toxocara canis en medio DME (ver anexo 11). La concentración de trabajo estandarizada para ELISA es de 2.5 µg/ml de antígeno.

Suero

La dilución estandarizada de suero es de 1:800, es decir, una parte de suero por 800 partes de solución de trabajo PBS más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14). Las muestras problema y los sueros controles positivo y negativo se preparan a esta dilución.

Conjugado (anticuerpo secundario)

La solución de trabajo del conjugado corresponde a anti-IgG humana marcada con fosfatasa alcalina en una dilución de 1:1500, es decir, una parte de conjugado por 1500 partes de solución de trabajo PBS-T20 (ver anexo 14).

Sustrato

El sustrato utilizado es una solución de paranitrofenilfosfato diluido en dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15) en una proporción 1:1 w/v (1 mg de paranitrofenilfosfato diluido en 1 ml de solución reguladora de dietanolamina). La reacción se detiene con NaOH 3N (ver anexo 16).

Punto de corte

Valores de absorbancia mayores o iguales a 0.4 son considerados positivos; valores de absorbancia menores que 0.4 se consideran negativos.

Procedimiento

En la figura 1.2, se esquematiza el procedimiento ELISA indirecto para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-Toxocara canis.

Figura 1.2. Procedimiento para la realización de la prueba de ELISA indirecto.

Fuente: cortesía de Olga Lucía Morales Reyes.

1. Agregar 100 µl de la solución reguladora de revestimiento en cada pozo con el antígeno secretorio/excretorio de Toxocara canis.

2. Incubar las microplacas en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 horas.

3. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

4. Agregar 100 µl de las diluciones de los sueros problema. Las muestras se sirven por triplicado. Dejar seis pozos de la placa libres de suero; estos pozos se utilizan como control de antígeno (tres de ellos) y control de conjugado (los tres restantes). Los seis pozos de control se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 horas.

5. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

6. Agregar 100 µl de la dilución del conjugado en cada pozo, excepto en los tres pozos que sirven como control de antígeno; estos pozos se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a 4 °C durante 18 horas.

7. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

8. Agregar 100 µl de la solución de sustrato en cada uno de los pozos.

9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y detener la reacción añadiendo 25 µl de NaOH 3N a cada pozo.

10. Leer la absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Confrontar las lecturas obtenidas con el valor de punto de corte establecido, revisar los resultados del control positivo y negativo y hacer el reporte correspondiente.

Los resultados se reportan como reactivo (RE) o no reactivo (NR), colocando en todos los casos el valor numérico de la absorbancia. El formato de reporte de resultados debe incluir un párrafo de interpretación que especifique el punto de corte de la técnica. Los valores de absorbancia iguales o mayores que 0.4 se consideran positivos, mientras que valores de absorbancia menores que 0.4 son negativos.

Diagnóstico de Enterobius vermicularis

Método de Graham o de la cinta engomada

Este método se fundamenta en el hecho de que la hembra adulta de Enterobius vermicularis no deposita sus huevos en el interior del intestino del humano, sino que durante la noche migra hacia las márgenes del ano y deposita los huevos en los pliegues perianales. Por esta razón, se le debe indicar al paciente que no puede bañarse antes de defecar el día de la colecta y la muestra se debe tomar en horas de la mañana. A fin de aumentar la sensibilidad de la técnica, se pueden tomar tres muestras en días diferentes de la semana (24).

Con esta técnica se pueden observar huevos de otros parásitos como Taenia spp., Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e Hymenolepis nana, entre otros.

Materiales y reactivos para la obtención y la lectura de la muestra

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: guantes de látex, cinta adhesiva transparente, bajalenguas, portaobjetos y microscopio.

Procedimiento

En la figura 1.3, se esquematiza el procedimiento para la obtención de la muestra del método de Graham o cinta engomada.

Figura 1.3. Procedimiento para la toma de muestra del método de Graham.

Fuente: cortesía de Juan Edwin Villalobos Ospina.

1. Colocar la cinta transparente, con la parte adherente hacia fuera, sobre un extremo del bajalenguas. La cinta se sujeta con ayuda de los dedos pulgar e índice. El tamaño de la cinta debe ser de aproximadamente 13 cm de largo por 2 cm de ancho.

2. Hacer varias aplicaciones en la superficie de la región perianal del paciente.

3. Separar con cuidado la cinta del bajalenguas y colocarla sobre un portaobjetos, evitando la formación de burbujas.

4. Observar al microscopio con objetivo de 10X.

INFECCIONES POR PROTOZOOS INTESTINALES

Según la OMS, los protozoos intestinales son la segunda causa de morbilidad y mortalidad en menores de 5 años. Dentro de este grupo se encuentran principalmente Entamoeba histolytica, Giardia duodenalis y Cryptosporidium spp. Existen otros parásitos intestinales menos frecuentes como Balantidium coli, Cystoisospora belli, Cyclospora cayetanensis y Blastocystis hominis, que también producen patología en humanos. Por otra parte, existen protozoos en el intestino considerados comensales no patógenos, tales como Endolimax nana, Iodamoeba butschlii, Entamoeba hartmanni, Entamoeba dispar, Entamoeba coli, Chilomastix mesnili y Trichomona hominis (25-28).

Dentro de la gran variedad de parásitos que afectan a los niños, los protozoos intestinales suelen ser de difícil identificación, debido a la variabilidad en la cantidad de formas de resistencia (quistes y ooquistes) eliminadas en la materia fecal o la dificultad en la detección de los trofozoítos, pues por lo general, las muestras no llegan al laboratorio en buenas condiciones o no se examinan durante el lapso de tiempo adecuado. El diagnóstico de estas patologías se hace por medio de exámenes directos, de concentración, pruebas inmunológicas, cultivos y pruebas moleculares (25-28).

Examen directo en materia fecal

El examen directo de materia fecal es el método de elección para identificar las formas parasitarias (quistes y trofozoítos) de amibas y flagelados intestinales como Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii, Iodamoeba butschlii, Endolimax nana, Entamoeba coli, Entamoeba hartmanni, Giardia duodenalis, Chilomastix mesnili, Trichomona hominis, Blastocystis hominis y Balantidium coli (8,9).

Recolección de la muestra

La toma de muestra de materia fecal debe hacerse directamente desde el paciente y no desde el suelo o la taza sanitaria; los recipientes de la recolección deben estar limpios y facilitar el transporte seguro de la muestra. A fin de preservar los trofozoítos, se debe evitar el contacto de la muestra con la orina (7).

En caso de disentería, es importante examinar la muestra en los primeros 20 minutos después de la recolección; pasado ese tiempo, los trofozoítos comienzan la autolisis, lo que dificulta la identificación de Entamoeba histolytica. Si se observan zonas con moco y sangre, se prefiere que el examen microscópico se realice en ellas, ya que existe mayor probabilidad de encontrar los trofozoítos de E. histolytica o Balantidium coli (7).

Examen directo en solución salina fisiológica

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: portaobjetos, cubreobjetos y solución salina al 0.85 % (ver anexo 1) (8,9).

Procedimiento

1. Colocar una gota de solución salina sobre un portaobjetos.

2. Tomar pequeñas cantidades de materia fecal de diferentes partes de la muestra con el extremo de un aplicador.

3. Homogenizar la materia fecal tomada con el aplicador en la gota de solución salina.

4. Colocar un cubreobjetos y observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X.

El examen directo en solución salina es útil para observar trofozoítos en movimiento, quistes y ooquistes.

Examen directo en solución de yodo o lugol

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: portaobjeto, cubreobjetos y lugol (ver anexo 2) (8,9).

Procedimiento

Seguir los pasos descritos para el examen en solución salina fisiológica, pero en lugar de la solución salina, emplear una gota de solución yodada o lugol. Con esta técnica, se visualizan estructuras de los quistes y ooquistes, como los depósitos de glucógeno de color pardo rojizo, el citoplasma de coloración amarilla y el núcleo con la morfología característica de cada especie. Los trofozoítos se inmovilizan y se deforman de manera considerable.

Método de concentración de formol-éter

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: vasos desechables, aplicadores, bajalenguas, gasas, tubo de centrífuga, portaobjetos, cubreobjetos, formol al 10 % (ver anexo 3), éter etílico, solución salina al 0.85 % (ver anexo 1) y lugol (ver anexo 2) (8,10).

Procedimiento

1. Tomar aproximadamente 1 g de materia fecal con un bajalenguas y colocar la muestra en un vaso desechable.

2. Agregar 10 ml de formol al 10 % y homogenizar.

3. Filtrar a través de gasa doble en un tubo de centrífuga.

4. Agregar 1 ml de éter etílico y mezclar vigorosamente durante un minuto.

5. Centrifugar a 800 g durante 5 minutos.

6. Eliminar el sobrenadante.

7. Mezclar el sedimento con un aplicador y realizar el montaje en solución salina al 0.85 % y solución de lugol, como se describió en el aparte que referencia el examen directo en materia fecal.

Con este método se aumenta la probabilidad de encontrar los quistes u ooquistes de los protozoarios en las muestras.

Técnica de Ritchie-Frick modificada

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son los mismos que se utilizan en el método de concentración de formol-éter y solución alcohólica (ver anexo 4) (3,11,28).

Procedimiento

Con el fin de identificar protozoos intestinales, primero se lleva a cabo el protocolo para la identificación de helmintos y luego se continúa con el procedimiento para la identificación de protozoos.

Identificación de helmintos

1. Mezclar 2 g de materia fecal y 15 ml de formol al 10 % en un frasco.

2. Homogenizar y mezclar por agitación.

3. Filtrar a través de dos capas de gasa en tubo de centrífuga.

4. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos.

5. Anotar el volumen del sedimento y descartar el sobrenadante.

6. Multiplicar el volumen del sedimento por 7, agregar este valor en volumen de solución alcohólica y mezclar.

7. Colocar 0.05 ml de la suspensión en un portaobjetos, colocarle un cubreobjetos y observar al microscopio.

8. Realizar los recuentos de huevos y larvas de helmintos, promediar y multiplicar el valor por 160 en cada caso; este valor corresponde al número de huevos o larvas por mililitro de heces filtradas y sedimentadas.

Identificación de protozoarios

1. Completar el volumen restante de la suspensión anterior con solución alcohólica y centrifugar a 800 g durante 10 minutos.

2. Eliminar el sobrenadante y agregar el mismo volumen de solución alcohólica.

3. Agregar 3 ml de éter y homogenizar.

4. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos.

5. Eliminar el sobrenadante.

6. Colocar en un portaobjetos una gota de la suspensión para lugol y solución salina al 0.85 %, colocar un cubreobjetos y observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X, que posean micrómetro ocular.

Este método aumenta la probabilidad de encontrar los quistes u ooquistes de los protozoarios en las muestras examinadas.

Reporte de resultados

Las especies patógenas y no patógenas halladas en la muestra deben ser reportadas. Si se encuentran especies no patógenas, se considera como un indicio de que el paciente ha ingerido alimentos o bebidas contaminadas con materia fecal, lo cual sugiere una asociación con especies patógenas (29,30). Si se encuentran formas parasitarias morfológicamente compatibles con E. histolytica, se debe reportar como complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii (31).

Identificación del complejo Entamoeba histolytica/ Entamoeba dispar/Entamoeba moshkovskii

A continuación, se describen las técnicas utilizadas para la identificación del complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii, las cuales incluyen el examen con azul de metileno amortiguado y las coloraciones especiales.

Examen con azul de metileno amortiguado

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: portaobjetos, cubreobjetos, tubo de ensayo, aplicador, solución amortiguadora de acetato (ver anexo 17) y azul de metileno amortiguado (ver anexo 18) (7,31,32).

Procedimiento

1. Tomar una pequeña cantidad de materia fecal con un aplicador y llevarla a un tubo de ensayo.

2. Mezclar con una pequeña cantidad de azul de metileno amortiguado.

3. Incubar a 37 °C durante 15 minutos.

4. Hacer el montaje en un portaobjetos y colocarle un cubreobjetos.

5. Examinar la preparación en 10X y 40X.

A través de esta técnica, es posible observar las características morfológicas del núcleo de los trofozoítos. Esta característica y otros aspectos morfológicos enumerados en la tabla 1.2 facilitan la diferenciación de los trofozoítos de los macrófagos, los cuales también suelen estar presentes en la muestra y son un factor de confusión frecuente.

Tabla 1.2. Cuadro comparativo de las características de los trofozoítos y los macrófagos de

Coloraciones especiales

Las coloraciones especiales descritas a continuación incluyen la tinción con hematoxilina férrica y la tinción tricrómica.

Tinción de hematoxilina férrica

Esta técnica permite detallar la morfología del núcleo, el cariosoma, la membrana y la distribución de la cromatina, los cuerpos cromatoides y las vacuolas (35,36) como se puede observar en la tabla 1.3.

Tabla 1.3. Comparación de la morfología del complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii y otras amibas intestinales.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubo de cultivo de amibas o materia fecal, gasa, vasos desechables, tubos, centrífuga, agua destilada, papel secante, aplicadores, portaobjetos, soporte metálico, cubreobjetos, recipientes rectangulares con tapa, guantes desechables, tapabocas, fijador de Schaudinn (ver anexo 19), fijador de alcohol polivinílico (PVA, por su sigla en inglés) (ver anexo 20), etanol al 30 %, 50 %, 70 %, 85 % y 90 % (ver anexo 21), solución de albúmina (ver anexo 22), solución saturada de alcohol yodado (ver anexo 23), alumbre férrico (ver anexo 24), hematoxilina al 5 % (ver anexo 25), solución de ácido pícrico (ver anexo 26), xilol y líquido de montaje (citorresin).

Procedimiento

1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes de fijador de Schaudinn o fijador PVA y conservar hasta el momento de la coloración.

2. Filtrar la mezcla anterior con un pedazo de gasa.

3. Centrifugar el filtrado a 800 g durante 10 minutos.

4. Eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento con agua destilada y centrifugar a 400 g durante 10 minutos. Repetir este procedimiento mínimo tres veces o hasta obtener un sobrenadante transparente.

5. Preparar el etanol al 30 %, 50 %, 70 %, 85 % y 95 % a partir de alcohol al 100 %.

6. Preparar la solución saturada de alcohol yodado.

7. Montar los portaobjetos. Escurrir bien el líquido del tubo, colocarlo boca abajo sobre un papel secante durante unos pocos segundos y agregarle varias gotas de solución de albúmina para disolver el sedimento (entre cuatro o cinco gotas).

8. Tomar una gota del preparado y colocarla sobre un portaobjetos. Extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

9. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

10. Colocar los portaobjetos horizontalmente sobre un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con alcohol yodado durante 18 horas a temperatura ambiente.

11. Servir los alcoholes al 30 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 % y 100 % en su respectivo recipiente marcado y tapado.

12. Preparar el alumbre férrico.

13. Pasar los portaobjetos del alcohol yodado a etanol al 50 % durante 3 minutos; luego, a un recipiente con agua destilada durante 3 minutos, y por último, al recipiente con alumbre férrico durante 1 hora.

14. Preparar la hematoxilina al 5 %.

15. Preparar el ácido pícrico.

16. Colocar las placas en un recipiente con agua destilada durante 1 hora.

17. Colocar las placas en la solución de trabajo de hematoxilina al 5 % durante 2 horas. Si la solución de trabajo de la hematoxilina es de buena calidad, las placas tomarán un color morado.

18. Colocar las placas en un recipiente con ácido pícrico durante 1 minuto para decolorar. Tener cuidado de no exceder este tiempo.

19. Colocar las placas en un recipiente y dejarlo bajo el chorro de agua del grifo durante 30 minutos.

20. Pasar las placas por los recipientes con las diferentes concentraciones de alcohol de la siguiente forma: etanol al 30 % durante 15 minutos, etanol al 50 % durante 15 minutos, etanol al 70 % durante 30 minutos, etanol al 85 % durante 15 minutos, etanol al 95 % durante 25 minutos y etanol al 100 % durante 15 minutos.

21. Usar guantes y tapabocas para colocar las placas en xilol en un recipiente tapado adecuadamente. Evitar el contacto directo del xilol con la piel.

22. Sacar uno por uno los portaobjetos del recipiente con xilol y sin dejarlos secar, poner una o dos gotas de citorresin sobre el extremo del extendido. De inmediato, colocar una laminilla, hacer presión y permitir que la solución se difunda. Limpiar los excedentes de los bordes con una gasa antes de dejar secar.

23. Observar al microscopio de luz con objetivos de 10X, 40X y 100X.

Tinción tricrómica

Al igual que la tinción de hematoxilina férrica, la tinción tricrómica permite observar las estructuras morfológicas de quistes y trofozoítos (28,38,39), como se puede ver en la tabla 1.3.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: tubo de cultivo de amibas o materia fecal, gasa, vasos desechables, tubos, centrífuga, agua destilada, papel secante, aplicadores, portaobjetos, soporte metálico, cubreobjetos, recipientes rectangulares con tapa, guantes desechables, tapabocas, fijador de Schaudinn (ver anexo 19) o solución fijadora PVA (ver anexo 20), solución de albúmina (ver anexo 22), colorante tricrómico (ver anexo 27), solución saturada de alcohol yodado (ver anexo 23), etanol al 30 %, 50 %, 70 %, 85 % y 90 % (ver anexo 21), alcohol al 90 % acidificado (ver anexo 28), xilol y líquido de montaje (citorresin).

Procedimiento para realizar la tinción tricrómica con fijador de Schaudinn

1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes de fijador de Schaudinn y fijar a 50 °C durante 5 minutos o 1 hora a temperatura ambiente.

2. Filtrar la mezcla anterior con un trozo de gasa.

3. Centrifugar el filtrado a 800 g durante 10 minutos.

4. Eliminar el sobrenadante, resuspender el sedimento con agua destilada y centrifugar a 800 g durante 10 minutos. Repetir este procedimiento mínimo tres veces o hasta obtener un sobrenadante transparente.

5. Montar los portaobjetos. Escurrir bien el líquido del tubo, colocarlo boca abajo sobre un papel secante durante unos pocos segundos y agregar algunas gotas de solución de albúmina con el fin de disolver el sedimento (entre cuatro y cinco gotas, por lo general).

6. Tomar una gota del preparado, colocarla sobre una lámina y extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

7. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

8. Colocar los portaobjetos horizontalmente en un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con solución saturada de alcohol yodado durante 1 minuto.

9. Colocar los portaobjetos en alcohol al 70 % durante 1 minuto. Repetir este paso dos veces.

10. Colocar los portaobjetos en el colorante tricrómico de 2 a 8 minutos.

11. Colocar los portaobjetos en alcohol al 90 % acidificado de 10 a 20 segundos o hasta que haya decoloración completa.

12. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % y enjuagar dos veces.

13. Colocar los portaobjetos en xilol durante 1 minuto.

14. Realizar el montaje con bálsamo o cualquier otro líquido de montaje como citorresin.

Procedimiento para realizar la tinción tricrómica con fijador de alcohol polivinílico

1. Mezclar una parte de heces recién emitidas con tres partes del fijador PVA hasta el momento de la coloración.

2. Tomar una gota del preparado, colocarla sobre los portaobjetos y extenderla horizontalmente con un aplicador hasta obtener una película delgada.

3. Dejar secar el extendido a temperatura ambiente durante 1 hora.

4. Colocar los portaobjetos en sentido horizontal en un soporte metálico e introducirlos en un recipiente con alcohol yodado durante 10 minutos.

5. Sumergir los portaobjetos en alcohol al 70 % de 3 a 5 minutos y repetir este paso dos veces.

6. Colocar los portaobjetos en el colorante tricrómico de 6 a 8 minutos.

7. Colocar los portaobjetos en alcohol al 90 % acidificado de 10 a 20 segundos o hasta que haya decoloración completa.

8. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % y enjuagar.

9. Colocar los portaobjetos en alcohol al 95 % durante 5 minutos.

10. Colocar los portaobjetos en xilol de 5 a 10 minutos.

11. Realizar el montaje con bálsamo o cualquier otro líquido de montaje como citorresin.

Biopsia

El uso de exámenes endoscópicos de colon y recto permite la visualización directa de la lesión sugestiva en caso de cuadro clínico compatible con alguna forma de amibiasis intestinal (7). A su vez, este abordaje posibilita la toma de muestra de tejido de una o más lesiones, con el fin de realizar estudios histopatológicos (8,28,32). Los trofozoítos de E. histolytica se identifican a partir de la coloración del tejido con hematoxilina-eosina, pero en algunas ocasiones se requiere de la tinción tricrómica para diferenciar el trofozoíto de otras células.

Pruebas inmunológicas

Detección de Gal-NAc antilectina

La detección de Gal-Nac antilectina, es una técnica que posibilita la diferenciación entre la especie E. histolytica y la E. dispar a partir de muestras de materia fecal o aspirado de líquido del absceso hepático. En la actualidad, este método solo se encuentra disponible en algunos laboratorios de referencia y no se utiliza como prueba de rutina por sus altos costos (40,41).

Materiales y reactivos

Para este método, se utiliza el kit comercial de Techlab® T5017/30404 (42).

Recolección y manejo de las muestras

La muestra debe ser fresca, recién emitida o almacenada a una temperatura entre 2 °C y 8 °C y la prueba debe llevarse a cabo en las primeras 24 horas luego de la recolección. No deben usarse especímenes fecales recogidos o almacenados en fijadores como formalina al 10 %, solución acética y formol (SAF) o solución fijadora PVA. El congelamiento y descongelamiento de la muestra, sobre todo si se hace más de una vez, puede dar como resultado la pérdida de actividad, debido a la degradación de la adhesina.

Preparación de la muestra

Agregar entre 0.15 g y 0.20 g de materia fecal formada, 400 µl de materia fecal líquida o 400 µl de líquido de absceso hepático a un tubo marcado y añadir 400 µl de diluyente. Finalmente, mezclar en vórtex.

Procedimiento

1. Seleccionar un pozo de la placa de microtitulación como control negativo; otro, como control positivo y otro para la muestra.

2. Transferir 200 µl de la muestra preparada como se explicó antes, a cada uno de los pozos seleccionados para las muestras.

3. Agregar 50 µl del conjugado a todos los pozos.

4. Agregar 50 µl del control positivo al pozo de control positivo.

5. Agregar 100 µl del diluyente al pozo de control negativo.

6. Cubrir los pozos con el adhesivo disponible en el kit.

7. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.

8. Eliminar el contenido de los pozos.

9. Lavar cuatro veces con solución de lavado 1X.

10. Secar sobre papel absorbente.

11. Agregar 100 µl del sustrato a todos los pozos.

12. Mezclar suavemente.

13. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

14. Agregar 50 µl de solución de parada.

15. Mezclar con suavidad.

16. Leer en espectofotómetro a una longitud de onda de 450 nm.

17. Para el cálculo de los resultados, determinar el valor de la absorbancia de los controles positivo y negativo y de las muestras. Restar el valor de absorbancia del control negativo al valor de las muestras. Se considera una muestra positiva si el resultado de la resta de absorbancias es mayor que 0.051.

Pruebas de biología molecular

Reacción en cadena de polimerasa

Al igual que las pruebas para la detección de lectina Gal-NAc para la diferenciación del complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii, la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por su sigla en inglés) es una técnica que solo está disponible en algunos laboratorios de referencia en Colombia y no es utilizada como prueba de rutina para el diagnóstico de la amibiasis (34,43).

Mantenimiento de cultivos (controles positivos, controles negativos y muestras)

Ver mantenimiento de cultivos mixtos y axénicos en los apéndices referentes al cultivo axénico de cepa de referencia HM1:IMSS para E. histolytica (ver anexo 42) y antígeno de E. histolytica.

• Controles positivos para E. histolytica y E. dispar: Los controles positivos utilizados son las cepas de referencia HM1:IMSS para E. histolytica y SAW 760 para E. dispar.

• Control negativo: Como control negativo, se utiliza una cepa de Entamoeba invadens.

• Recuento celular: Realizar tres lavados con solución tampón de fosfatos a 4 °C (PBS 0.02 M, pH 7.4) (ver anexo 29) a 700 g y 4 °C durante 5 minutos y resuspender el sedimento en la misma solución. Llevar a cabo el recuento celular en cámara de Neubauer para calcular la cantidad de ADN esperada luego del proceso de extracción, con la siguiente fórmula:

N.° promedio de trofozoítos/volumen de resuspensión x 10 000 = N.° de trofozoítos/ml

Después del recuento, se realiza una centrifugación con las mismas condiciones utilizadas en los lavados. Luego, el sedimento se congela a -196 °C en nitrógeno líquido y se almacena a -20 °C hasta la extracción del ADN (44).

• Procesamiento de muestras: Para el procesamiento de muestras, primero, es necesario cultivar las muestras de materia fecal positivas por microscopía para el complejo E. histolytica/E. dispar/E. moshkovskii en medio de Robinson para realizar el aislamiento primario (ver anexo 30) (45). Después de 8 días de observación, descartar los aislamientos negativos. Con los aislamientos positivos, realizar repiques sucesivos cada 48 horas como se describe en el aparte sobre mantenimiento de cultivos mixtos. Para finalizar, se hace el recuento celular de la manera antes descrita.

Extracción de ADN mediante lisis no alcalina

El proceso de lisis no alcalina es una modificación de la lisis alcalina, en el cual se prescinde del uso de ditiotreitol (DTT) e hidróxido de sodio (NaOH) en el proceso inicial de la lisis. Esta modificación ha sido descrita en procesos de extracción de ADN de protozoarios intestinales (25,43,46-51,52).

Procedimiento

1. Incorporar Tris-HCl 2M pH 8.3 (ver anexo 31) directamente al concentrado celular congelado y mantenido sobre hielo. Mezclar la suspensión con suavidad y purificar el ADN con 250 μl de fenol equilibrado/cloroformo/alcohol isoamílico (PCI, por su sigla en inglés), en una relación 25:24:1.

2. Separar las fases mediante centrifugación a 800 g durante 2 minutos en minicentrífuga. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo, en el cual se realiza una segunda purificación con un volumen de cloroformo.

3. Precipitar el ADN de la segunda fase acuosa en acetato de amonio 2 M (ver anexo 32) y dos volúmenes de etanol absoluto a 20 °C. Mezclar por inversión muy suavemente e incubar durante toda la noche a -20 °C.

4. Centrifugar a 1000 g y 4 °C durante 5 minutos. Resuspender el sedimento obtenido en 500 μl de etanol al 70 % e incubar durante 10 minutos a 20 °C. Centrifugar a 1500 g y 4 °C durante 10 minutos.

5. Evaporar completamente el etanol. Resuspender el ADN en 100 µl de buffer Tris Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, por su sigla en inglés) 10 mM (ver anexo 33).

6. Correr una electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % (ver anexo 34) y almacenar el ADN extraído a -20 °C hasta su utilización en la PCR.

7. Cuantificar el ADN mediante espectrofotometría.

Protocolo de reacción en cadena de polimerasa

1. Realizar la amplificación en un volumen final de 20 µl. Los cálculos por muestra son: 2 µl de buffer 1X (Sigma®), 1 μl de mezcla de dNTP’s 1.25 mM (Invitrogen®), 2.4 µl de MgCl2 6 mM (TucanTaq®), 0.2 μl de cada uno de los tres oligos 0.2 µM, 0.2 μl de polimerasa Taq (TucanTaq®) 0.05 U/µl, 4 μl de ADN y agua ultrapura estéril para completar el volumen final.

2. Iniciar la programación del termociclador con una primera desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos, seguida de 30 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, 58 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 1 minuto, y una extensión final a 72 °C durante 10 minutos.

3. Utilizar geles de agarosa al 1.5 % (ver anexo 35) teñidos con bromuro de etidio para la visualización de productos de la electroforesis corrida a 105 V/cm durante 45 minutos. La combinación de oligonucleótidos en una misma mezcla de reacción genera productos de 166 pb para el ADN de E. histolytica y de 752 pb para el ADN de E. dispar.

La secuencia del oligonucleótido sentido (EntaF) se diseñó sobre la región central de la subunidad pequeña del gen rRNA, la cual está conservada en ambas especies de Entamoeba, mientras que los oligonucleótidos antisentido (EhR y EdR), específicos para E. histolytica y E. dispar, se diseñaron según las secuencias variables de la subunidad pequeña del rRNA 16S. Las secuencias son EntaF: 5’-ATG CAC GAG AGC GAA AGC AT-3’; EhR: 5’-GAT CTA GAA ACA ATG CTT CTC T-3’, y EdR: 5’-CAC CAC TTA CTA TCC CTA CC-3’. La especificidad de los oligonucleótidos se establece al comparar con la totalidad de secuencias disponibles en GenBank, donde el oligonucleótido sentido (EntaF) se encuentra solo en el género Entamoeba y los oligonucleótidos antisentido (EhR y EdR), en secuencias específicas de cada una de las especies del complejo (53).

Diagnóstico de la amibiasis extraintestinal

Para el diagnóstico de la amibiasis extraintestinal, se utilizan pruebas inmunológicas que detectan anticuerpos. A pesar de que estos anticuerpos permanecen durante largo tiempo en el suero, su asociación con los hallazgos clínicos e imagenológicos es fundamental para el diagnóstico etiológico correcto (54). Entre las pruebas más utilizadas, se pueden hallar la aglutinación en látex, inmunodifusión (ID), contrainmunoelectroforesis (CIE), hemaglutinación indirecta (HAI), ELISA y western blot (WB).

La identificación de E. histolytica se lleva a cabo en material del absceso hepático, peritoneo, material expectorado y piel. Entre las fortalezas de estas pruebas figura su aporte en el desarrollo de estudios seroepidemiológicos, que indican el nivel de saneamiento básico de la población (33,55).

Técnicas inmunológicas

Las técnicas inmunológicas que se utilizan de rutina para la detección de anticuerpos son ID, CIE y ELISA.

Inmunodifusión

La inmunodifusión, llamada también análisis de Ouchterlony, es una técnica de precipitación sencilla basada en el principio de la reacción antígeno-anticuerpo, en la cual el antígeno soluble y el anticuerpo homogenizado se difunden a través de un medio semisólido y forman complejos inmunes estables que pueden ser visualizados como una banda de precipitación. Este método se realiza sobre agar en una caja de Petri o una placa de vidrio y las soluciones de antígeno y anticuerpo se colocan en pozos adyacentes, permitiendo que difundan el uno hacia el otro (56).

La localización de las bandas de precipitación depende de las concentraciones relativas de antígeno y anticuerpo que se colocan en los pozos. Si la concentración del antígeno es menor que la del anticuerpo, entonces el anticuerpo se difundirá más lejos del pozo para reaccionar con el antígeno. Si el anticuerpo está relativamente diluido en comparación con el antígeno, las bandas de precipitación tienden a formarse más cerca del pozo que contiene el anticuerpo. Asimismo, el tamaño molecular del antígeno y del anticuerpo influye en la formación de las bandas de precipitación. Los componentes de alto peso molecular, tales como las moléculas de IgG, tienden a difundirse con lentitud en el gel y, por lo tanto, sus bandas de precipitación se formarán más cerca al pozo donde están estos anticuerpos (56). La figura 1.4. esboza los tres patrones de bandas de precipitación posibles en la inmunodifusión y la explicación de cada resultado.

A. Reacción de identidad: existe identidad inmunoquímica antígeno-anticuerpos y se forma una sola línea de precipitado. Puede ser utilizada como una evaluación cuantitativa de la pureza del antígeno y del anticuerpo.

B. Reacción de no identidad: no existe identidad entre los anticuerpos y el antígeno. Se visualiza porque las líneas de precipitación se cruzan completamente.

C. Reacción de identidad parcial: sugiere identidad parcial de los anticuerpos y el antígeno (los determinantes antigénicos son compartidos parcialmente por los anticuerpos); se forma una línea que no se cruza

Figura 1.4 Montaje, patrones de bandas de precipitación e interpretación de resultados en la inmunodifusión.

Fuente: cortesía de Andrés Melo.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: cajas de Petri, micropipetas automáticas y puntas, pipetas, balón volumétrico, tapón de algodón forrado con papel aluminio, perforador en forma de margarita, agujas con bisel, agarosa al 1.3 % (ver anexo 36) y solución salina al 0.85 % (ver anexo 1).

Procedimiento

1. Servir 25 µl de antígeno de E. histolytica en el pozo central del gel de agarosa al 1.3 %. En uno de los pozos laterales, servir 25 µl del suero control positivo y en otro pozo, servir la misma cantidad del suero control negativo. De cada suero problema se sirven 25 µl en los pozos restantes. Es necesario dibujar un esquema de la ubicación de los sueros en el agar para consultarlo a la hora de la interpretación.

2. Incubar las muestras en el agar en cámara húmeda bien tapada a 37 °C entre 12 y 18 horas.

3. Colocar la placa en una solución de citrato de sodio al 5 % durante 1 hora a fin de eliminar las bandas inespecíficas.

4. Leer con transiluminación. Los resultados se interpretarán de acuerdo con los patrones de bandas de precipitación descritos en la figura 1.4.

Los resultados se reportan como reactivo (RE) o no reactivo (NR), describiendo el patrón de bandas de precipitación.

Coloración de la placa

Para visualizar mejor las bandas se puede colorear la placa con amido black.

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: placa de inmunodifusión, papel filtro, solución salina al 0.85 % (ver anexo 1), agua destilada, amido black al 0.7 % (ver anexo 37), solución de lavado (ver anexo 38) y citrato de sodio al 5 % (ver anexo 39).

▪ Procedimiento

1. Dejar la placa de id en solución salina al 0.85 % durante 18 horas.

2. Lavar con agua destilada durante 10 minutos.

3. Colocar un papel de filtro húmedo sobre la placa de agarosa y llevarla a 37 °C hasta que seque por completo.

4. Colocar la placa en amido black durante 10 minutos.

5. Lavar con agua destilada.

6. Dejar en solución de lavado hasta visualizar las bandas.

7. Colocar el gel en solución de citrato de sodio al 5 % para eliminar las bandas inespecíficas.

La observación de una sola banda de precipitación en la muestra problema se considera una reacción positiva.

Contrainmunoelectroforesis

Esta prueba fue descrita por primera vez en 1970 y desde entonces se ha utilizado para diagnosticar muchas enfermedades virales y parasitarias. Esta técnica se basa en la migración del antígeno y el anticuerpo y la formación de una banda de precipitación en un campo eléctrico. Es una prueba rápida, sensible y que requiere volúmenes mínimos de antígeno y anticuerpo. La sensibilidad de la prueba depende en gran medida de la estandarización de condiciones, como la determinación de las concentraciones óptimas de antígeno y anticuerpo, la selección adecuada del tipo de gel, el pH del buffer (8.2–8.6) y la ubicación adecuada de las muestras en los pozos para facilitar el contacto entre los reactantes (57).

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: pipetas de 10 ml y 20 ml, capilares, pipetas Pasteur, papel de filtro Whatman N.° 2, placas de vidrio, cámara para electroforesis, fuente de poder, agarosa al 1.3 % en solución amortiguadora con pH 8.6 (ver anexo 40), ácido acético glacial, amido black (ver anexo 37), solución de lavado (ver anexo 38), metanol y solución amortiguada 0.05 M con pH 8.6 (ver anexo 41).

Procedimiento

1. Cubrir una placa de vidrio de 8.5 cm x 10 cm con agarosa al 1.3 % en solución amortiguada 0.05 M, pH 8.6.

2. Incubar la placa en cámara húmeda por 30 minutos para permitir la solidificación del gel y, después, perforar pozos de 3 mm de diámetro en el agar con 4 mm de separación entre ellos.

3. Colocar el antígeno en su concentración óptima en la columna de la derecha. Hacer diluciones del suero problema (1:2 a 1:64) y disponerlas en la columna de la izquierda. Ubicar los sueros control positivo y negativo en los pozos inferiores.

4. Agregar 2 L de solución amortiguada 0.05 M, pH 8.6 en la cámara de electroforesis y ubicar dentro la placa de vidrio con las muestras.

5. Correr la electroforesis durante 60 minutos a un voltaje constante de 110 V a 140 V y un amperaje de 4 mA a 8 mA.

Antes de correr la CIE, es importante asegurarse de que los puentes de contacto y todos los demás componentes de la cámara estén bien colocados. No se debe conectar a la energía eléctrica hasta que la cámara esté llena y los contactos, revisados.

6. Desconectar la cámara de electroforesis luego de 60 minutos y colocar la placa de vidrio en agua destilada por 5 minutos. En este momento, deben observarse las bandas de precipitación de los controles, así como las bandas de precipitación de la muestra, en caso de que esta sea positiva.

7. Cubrir con papel de filtro húmedo y secar a 37 °C durante 12 horas, si se desea conservar la placa o fotografiar. Eliminar el papel de filtro y colorear la placa con amido black al 0.7 % durante 10 minutos, lavar con agua y dejar la placa 10 minutos en solución de lavado. El último lavado se realiza con agua destilada durante 5 minutos.

La presencia de una banda de precipitación se considera una reacción positiva. El título de la muestra está definido por la última dilución en la cual se observa esta banda.

Ensayo inmunoenzimático

Como se explicó en el aparte sobre el diagnóstico de Toxocara canis usando la técnica ELISA, esta prueba permite determinar la concentración de un antígeno o un anticuerpo en la muestra, mediante el uso de uno de ellos en fase sólida y el otro, en solución. La detección de la reacción antígeno-anticuerpo se realiza con una enzima (fosfatasa alcalina, peroxidasa, glucosa oxidasa o beta-D-galactosidasa) que reacciona con un sustrato específico y, de acuerdo con este mismo sustrato, se detiene la reacción usando ácidos o bases fuertes. La concentración de los productos enzimáticos se obtiene a través de la lectura de la densidad óptica en espectrofotómetro a la longitud de onda en la cual el color formado presenta su máxima absorción (58).

La detección de anticuerpos es la técnica que se usa con mayor frecuencia en Colombia. En el caso particular de la detección de anticuerpos anti-E. histolytica, el antígeno preparado a partir de cultivos axénicos de la cepa HM1:IMSS se fija en la fase sólida y luego se agrega la muestra (suero) en la que se sospecha que está el anticuerpo a determinar. Más adelante, se agrega el conjugado (anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina) dirigido contra el anticuerpo específico. Posteriormente, se añade el sustrato de la enzima, produciéndose una reacción colorimétrica cuantificada con espectrofotómetro. Al estandarizar la prueba, se establece el punto de corte con el cual se indica la positividad o negatividad de la muestra (55). A continuación, se describen las condiciones de trabajo estandarizadas en Colombia para esta prueba.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: placas de poliestireno de 96 pozos Immulon I, papel secante, nevera, cronómetro, micropipetas automáticas y puntas, frasco lavador, antígeno de E. histolytica (ver anexo 42), solución reguladora de revestimiento 0.05 M pH 9.6 (ver anexo 12), solución reguladora de fosfato (PBS) 0.15 M pH 7.4 (10X) (ver anexo 13), solución reguladora de fosfato (PBS) 0.15 M pH 7.4 más Tween 20 (PBS-T20) (ver anexo 14), solución reguladora de dietanolamina pH 9.8 (ver anexo 15) e hidróxido de sodio 3N (ver anexo 16).

Condiciones de trabajo utilizadas en Colombia

A continuación, se presentan las condiciones de trabajo estandarizadas en el laboratorio, para la realización del ELISA.

• Antígeno: se prepara a partir de cultivos axénicos de la cepa HM1:IMSS. La concentración de trabajo estandarizada para ELISA es de 1.25 µg/ml.

• Suero: la dilución estandarizada de suero es de 1:400, es decir, una parte de suero por 400 partes de solución de trabajo PBS-T20. Esta dilución es la misma para las muestras problema y los sueros controles (positivo y negativo).

• Conjugado: anti-IgG humana marcada con fosfatasa alcalina en una dilución de 1:15 000, es decir, una parte de conjugado por 15 000 partes de solución de trabajo PBS-T20. Esta concentración puede ser ajustada en función de la marca del anticuerpo conjugado.

• Sustrato: el sustrato de la fosfatasa alcalina es una solución de paranitrofenilfosfato en solución reguladora de dietanolamina pH 9.8, en proporción 1:1 w/v (1 mg de sustrato/1 ml de solución). La reacción se detiene con NaOH 3N.

• Punto de corte: el punto de corte de esta prueba diagnóstica es 0.34. Muestras con absorbancias mayores o iguales a 0.34 son consideradas positivas.

Procedimiento

1. Agregar 100 µl de la solución reguladora de revestimiento en cada pozo con el antígeno de E. histolytica.

2. Incubar las microplacas en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 3 horas.

3. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

4. Agregar 100 µl de las diluciones de los sueros problema. Las muestras se sirven por triplicado. Se dejan seis pozos de la placa libres, de los cuales tres serán utilizados como control de antígeno y los tres restantes, control de conjugado. Los seis pozos de control se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 horas.

5. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por lavado.

6. Agregar 100 µl de la dilución del conjugado en cada pozo, excepto en los tres pozos que sirven como control de antígeno; estos pozos se llenan con 100 µl de solución reguladora de PBS-T20. Incubar en cámara húmeda a 4 °C durante 18 horas.

7. Lavar tres veces con solución reguladora de PBS-T20 durante 5 minutos por cada lavado.

8. Agregar 100 µl de la solución de sustrato en cada uno de los pozos.

9. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y detener la reacción añadiendo 25 µl de NaOH 3N a cada pozo.

10. Leer la absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm. Confrontar las lecturas obtenidas con el valor de punto de corte establecido, revisar los resultados del control positivo y negativo y hacer el reporte correspondiente.

Los resultados se reportan como reactivo (RE) o no reactivo (NR), colocando en todos los casos el dato de la absorbancia. El formato debe incluir un párrafo de interpretación que especifique el punto de corte de la técnica empleada. Se consideran valores de absorbancia positivos mayores o iguales a 0.34, mientras que los valores de absorbancia menores a esta cifra son negativos. En la figura 1.2 se esquematiza el procedimiento ELISA indirecto para la detección de anticuerpos tipo IgG anti-E. histolytica.

Hemaglutinación indirecta

En esta técnica se utilizan glóbulos de carnero previamente tratados con ácido tánico y sensibilizados con antígeno de E. histolytica en presencia del suero problema con sospecha de amibiasis (59).

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: antígeno de E. histolytica (ver anexo 42), glóbulos rojos, glutaraldehído al 1 % (ver anexo 43), solución salina al 0.85 % (ver anexo 1), PBS pH 7.2 (ver anexo 44), ácido tánico en dilución 1:15 000 (ver anexo 45) y azida de sodio al 1 % (ver anexo 46).

Procedimiento

▪ Tratamiento de las células rojas con glutaraldehído

1. Centrifugar la sangre total de carnero por 3 minutos a 800 g.

2. Lavar los glóbulos rojos tres veces con solución salina al 0.85 % a 800 g durante 5 minutos.

3. Mezclar el precipitado con glutaraldehído al 1 %.

4. Incubar a 4 °C en agitación durante 30 minutos (agitador magnético).

5. Eliminar el glutaraldehído por centrifugación.

6. Lavar los glóbulos rojos cinco veces con agua destilada y cinco veces con solución salina fría al 0.85 %.

7. Utilizar las células en solución salina para preparar una dilución de células al 20 % con azida de sodio al 1 % y almacenar a 4 °C.

▪ Tratamiento de las células rojas con ácido tánico

1. Centrifugar las células rojas mantenidas en azida de sodio al 1 % durante 10 minutos a 800 g para concentrarlas al 100 %.

2. Diluir las células a una concentración de 2 % con solución salina fría al 0.85 %.

3. Mezclar la solución de células al 2 % y el ácido tánico 1:15 000 en proporción 1:1 (volumen a volumen o v/v).

4. Incubar a 37 °C durante 40 minutos.

5. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos y lavar dos veces con solución salina fría al 0.85 % para eliminar el exceso de ácido tánico y concentrar los glóbulos rojos al 100 %.

▪ Sensibilización de glóbulos rojos

1. Diluir el antígeno de E. histolytica a su concentración óptima utilizando PBS pH 7.2.

2. Diluir los glóbulos rojos tratados con ácido tánico y concentrados al 100 % en la dilución óptima del antígeno hasta obtener una concentración de células del 2 %.

3. Incubar a 37 °C durante 50 minutos, mezclando simultáneamente.

4. Centrifugar y lavar las células dos veces en solución salina al 0.85 %.

5. Suspender los glóbulos rojos al 2 % en solución salina al 0.85 %.

▪ Titulación del antígeno de E. histolytica

1. Realizar diluciones seriadas del antígeno (1:2) en PBS pH 7.2, partiendo de una dilución 1:10 y finalizando en 1:40.

2. Aplicar la técnica de microhemaglutinación con los correspondientes sueros controles positivos y negativos.

La dilución óptima del antígeno es la dilución máxima capaz de reaccionar con la dilución más alta del suero control positivo.

▪ Técnica de microhemaglutinación

1. Inactivar los sueros de control (positivo y negativo) y los sueros problema a 56 °C durante 30 minutos.

2. Preparar una dilución de suero de conejo al 2 % en PBS pH 7.2.

3. Agregar 50 µl de suero de conejo diluido al 2 % a 12 pozos de la placa de microtitulación.

4. Agregar 50 µl de cada suero inactivado en los pozos destinados a los sueros problema, control positivo y control negativo.

5. Realizar diluciones sucesivas, transfiriendo 50 µl a los pozos inferiores hasta obtener una dilución 1:4000 y eliminar la última dilución.

6. Agregar 25 µl de glóbulos rojos sensibilizados con el antígeno de E. histolytica a todos los pozos.

7. Mezclar con suavidad por agitación, dejar en reposo de 2 a 3 horas y cubrir la placa con papel celofán.

8. Realizar la lectura de la prueba. Si existen anticuerpos contra E. histolytica, se observará una malla de aglutinación, lo que se considera una prueba positiva en la dilución correspondiente. En la prueba negativa, se observa un punto en el fondo del pozo.

Western blot

El western blot es una técnica inmunológica que ayuda a determinar la presencia de proteínas de cierto peso molecular en pacientes con infección por E. histolytica reciente o pasada. En un estudio realizado en pacientes colombianos diagnosticados con absceso hepático amibiano, se identificó una banda de 38 kDa en el 93 % de los pacientes, una de 42 kDa en el 90 % y una de 80 kDa en el 86 %. En pacientes con absceso hepático mixto, las bandas de 80 kDa y 38 kDa fueron identificadas en el 100 % de los pacientes y la de 42 kDa, en el 75 % de ellos (60).

En otro estudio, que evaluó la frecuencia de bandas entre pacientes con infección reciente y pasada por E. histolytica, se encontraron bandas de 136 kDa, 132 kDa, 93 kDa, 70 kDa y 62 kDa en pacientes con absceso hepático amibiano, y bandas de 144 kDa, 140 kDa y 94 kDa asociadas con infección pasada (61). La figura 1.5 muestra el procedimiento de la realización de western blot para la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE, por su sigla en inglés) en medio discontinuo denaturante y la detección de anticuerpos anti-E. histolytica.

Figura 1.5. Procedimiento para la realización del western blot.

Fuente: cortesía de Olga Lucía Morales Reyes.

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico en medio discontinuo denaturante

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: un par de vidrios con separadores; un peine del grosor de los separadores; un par de sujetadores (clamps) para vidrios; un stand para colocar el sándwich de electroforesis; cámaras de electroforesis; fuente de poder ajustable a corriente continua; tubos plásticos para centrífuga; baño serológico a ebullición; agua bidestilada; agua saturada con N-butanol (ver anexo 47) —este reactivo es opcional—; solución A: monómero para gel de separación (ver anexo 48); solución B: buffer para gel de separación (ver anexo 49); solución C: monómero para gel de stacking (ver anexo 50); solución D: buffer para gel de stacking (ver anexo 51); persulfato 2 % (ver anexo 52); gel de sellado (ver anexo 53); gel de corrido o separación (ver anexo 54); gel de stacking (ver anexo 55); buffer de Laemmli 2X o 4X (ver anexo 56); buffer de corrido (ver anexo 57); pipetas de 10 ml; micropipetas; tetrametiletilendiamina (TEMED); puntas para micropipetas; pipeteador; bisturí; guantes, y tapabocas.

▪ Precaución

Se debe siempre utilizar guantes de protección química EN374, a fin de evitar que los vidrios se engrasen y para protección personal, ya que los monómeros de acrilamida son neurotóxicos.

▪ Procedimiento

1. Lavar los vidrios, preferiblemente, con detergente 1A y agua abundante y manipularlos con sumo cuidado.

2. Secar los vidrios con papel absorbente, teniendo la precaución de que no queden residuos de grasa, jabón o papel.

3. Ensamblar la cámara de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4. Preparar 1 ml de persulfato de sodio al 2 %.

▪ Preparación del gel de sellado

1. Preparar el gel de separación sin aplicar persulfato ni TEMED. Para ello, agregar agua bidestilada, solución A y B.

2. En otro recipiente, separar 1 ml de la mezcla para gel de separación y agregar el persulfato y el TEMED. Servir con rapidez para evitar la polimerización.

3. Agregar 300 µl de la mezcla del gel de sellado en el sándwich de los vidrios, procurando hacerlo con rapidez y por las esquinas del montaje. Esperar que el gel polimerice de 20 a 30 segundos.

▪ Preparación del gel de separación

1. Agregar persulfato y TEMED a la solución de gel de separación restante.

2. Añadir la solución al sándwich de vidrios. Para ello, se utiliza una micropipeta de 1 ml (mínimo) y se vierte la solución con rapidez por las esquinas del montaje; se agregan aproximadamente 4 ml entre los vidrios a fin de dejar libre el espacio correspondiente al gel de stacking.

3. Agregar 450 µl etanol antes de que la acrilamida se polimerice. El etanol formará una capa a nivel a través de la superficie del gel en 1 o 2 minutos. Cuando el gel se polimerice, se observará una interfase nítida entre el etanol y el gel. En ese momento, retirar el etanol y secar con papel filtro.

4. Si el gel no se va a utilizar el mismo día, agregar agua bidestilada y 1 ml de solución B diluida 1:4. Almacenar el gel a 4 °C.

▪ Preparación del gel de stacking

1. Preparar la solución de gel de stacking.

2. Agregar la solución al sándwich de vidrios como se explicó antes. Por cada gel se utilizan aproximadamente 2.5 ml de esta solución. Llenar por completo el espacio disponible en el sándwich para este gel.

3. Introducir con cuidado el peine de plástico y evitar la formación de burbujas, porque inhiben la polimerización de la acrilamida y causan distorsión local en el fondo de los pozos.

4. Esperar por lo menos 10 minutos a que el gel polimerice.

Se recomienda no correr patrones de peso molecular en los pozos de los extremos del gel.

▪ Preparación de la muestra

1. Mezclar tres partes de la muestra con una parte de buffer Laemmli 4X; si el buffer es 2X, la relación entre muestra y buffer es de 1:1. Mezclar y llevar a ebullición durante 5 minutos. Ejemplo: 80.33 µl de antígeno + 66.67 µl PBS 1X + 50 µl buffer Laemmli 4X.

2. Retirar el peine. Para correr una sola muestra se pueden cortar los dientes restantes con bisturí, limpiando bien los restos del gel. Llevar a cabo el montaje del sándwich en la cámara de electroforesis.

3. Agregar buffer de corrido entre los bloques de la cámara para verificar que no se salga.

4. Colocar el sándwich y la cámara superior en su sitio, llenar con buffer de corrido por dentro y por fuera de la cámara hasta aproximadamente la mitad del nivel de contenedor.

5. Servir la muestra en los pozos con una pipeta. El patrón puede depositarse en uno de los pozos centrales del gel.

▪ Corrido electroforético

1. Colocar los electrodos en su lugar, asegurando que el cátodo quede en la parte superior.

2. Fijar la fuente de poder en la selección de corriente constante.

3. Correr la electroforesis inicialmente a 75 V por 15 minutos aproximadamente y cuando la muestra se acumule al fondo de los pozos, cambiar a un voltaje constante de 125 V. Dejar que el corrido continúe bajo estas condiciones durante 1 hora.

4. Detener el corrido cuando el frente de color esté en el borde del gel.

5. Sacar la cámara del contenedor y continuar con la transferencia.

Electrotransferencia de proteínas a papel de nitrocelulosa

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para este método son: cámara de electrotransferencia, dos hojas de papel Whatman de 3 mm x 14 cm x 16 cm, una hoja de papel de nitrocelulosa de 14 cm x 16 cm, buffer de transferencia (ver anexo 58), guantes, tubo de ensayo grande y cuarto frío o recipientes con hielo para enfriar la cámara de transferencia.

▪ Procedimiento

Precaución: utilizar guantes durante todo el procedimiento y manipular con cuidado el papel de nitrocelulosa para evitar que se ensucie. Iniciar el procedimiento lo más pronto posible después de terminar la electroforesis, a fin de disminuir la difusión de bandas.

1. Llenar la cámara de electrotransferencia con cantidad suficiente de buffer de transferencia.

2. Depositar el gel de corrido —el gel de stacking no es necesario para la transferencia— sobre una de las hojas de papel Whatman y colocarlo sobre una de las rejillas con espuma.

3. Colocar el papel de nitrocelulosa encima del gel y eliminar las burbujas. Colocar encima la otra hoja de papel Whatman y hacer presión sobre el montaje, al rodar un tubo de ensayo limpio sobre el papel Whatman para eliminar las burbujas entre el gel y el papel de nitrocelulosa.

4. Colocar encima la otra espuma y la otra rejilla. Asegurar el montaje y colocarlo en la cámara de electrotransferencia, confirmando que el papel de nitrocelulosa quede hacia el ánodo (+).

5. Programar las condiciones de la transferencia. Si se realiza con dos membranas se programan 150 mA durante 2 horas y media, mientras que, para un solo gel, se tarda 1 sola hora. La transferencia se hace a 4 °C, ya que el proceso puede ocasionar el calentamiento excesivo de la cámara.

Coloración de la transferencia con rojo Ponceau

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: rojo Ponceau (ver anexo 59), agua bidestilada, refractaria y solución para lavados (ver anexo 60).

▪ Procedimiento

1. Colocar la membrana en una refractaria limpia.

2. Lavar la membrana de nitrocelulosa con agua bidestilada.

3. Añadir rojo Ponceau en cantidad suficiente para cubrir la membrana y dejar en remojo durante 5 minutos.

4. Decolorar la membrana con agua bidestilada o solución de lavado para inmunoblot. Comprobar la aparición de bandas coloreadas de rojo, lo que indica el éxito de la transferencia. Lavar hasta que las bandas desaparezcan por completo.

Inmunoblot y revelado con fosfatasa

▪ Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: solución de trabajo PBS+Tween 20 PBS-T20 (ver anexo 14), solución para lavados (ver anexo 60), solución bloqueadora de actividad endógena (ver anexo 61), solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión (ver anexo 62) y solución activadora de la fosfatasa y solución reveladora (ver anexo 63).

▪ Procedimiento

1. Cortar la membrana en tiras de 0.6 cm de ancho, con cuidado de no cortar por el medio del frente de corrida de las bandas. Identificar uno de sus extremos con una marca de lápiz y colocar las tiras en tubos de ensayo limpios y llenos de agua bidestilada.

2. Colocar las tiras en solución bloqueadora de actividad endógena por 1 hora y luego realizar tres lavados con solución de lavado durante 5 minutos.

3. Colocar las tiras en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión y mantener a 4 °C y en agitación constante durante toda la noche; esto permite que las proteínas de la leche utilizada en la solución bloqueadora se peguen a los espacios vacíos de la membrana. El bloqueo también puede realizarse a 37 °C durante 1 hora.

4. Diluir la muestra (suero o sobrenadante) en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión recién preparada. La dilución del suero depende de la concentración de anticuerpos de este y de la concentración de proteínas en la transferencia, por lo cual inicialmente se deben probar diferentes diluciones (1:50, 1:100).

5. Incubar a 4 °C toda la noche o 1 hora a temperatura ambiente, con agitación constante. Luego, lavar la membrana cinco veces por 5 minutos en cada oportunidad con solución de trabajo PBS-T20.

6. Diluir el conjugado (anti-IgG o anti-IgM) en solución bloqueadora de sitios inespecíficos de unión. La dilución del conjugado se ajusta según la resolución de las bandas y el background obtenido. Por lo general, se recomiendan diluciones de conjugado de 1:2000, 1:10 000 o 1:20 000, según las indicaciones de cada casa comercial.

7. Incubar 1 hora a temperatura ambiente y en agitación constante. Posteriormente, lavar cinco veces durante 5 minutos en cada ocasión, con PBS-T20.

▪ Revelado con fosfatasa alcalina

1. Lavar la membrana con solución activadora por 10 minutos.

2. Adicionar la solución reveladora y detener la reacción cuando las bandas muestren buena visibilidad. Este procedimiento se lleva a cabo a temperatura ambiente.

3. Preparar el volumen necesario de solución reveladora. Para prepararla, por cada 10 ml de solución activadora, agregar 33 µl de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) y 66 µl de nitro azul de tetrazolio (NBT).

4. Descartar la solución reveladora restante (ver figura 1.5).

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CAPÍTULO 2
TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA LA DETECCIÓN DE PARÁSITOS TISULARES (TRIPANOSOMIASIS AMERICANA, LEISHMANIASIS, TOXOPLASMOSIS Y MALARIA)
TRIPANOSOMIASIS AMERICANA

La tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi, el cual es transmitido por insectos hematófagos de la familia Reduviidae. Se estima que en el mundo existen aproximadamente 10 millones de personas infectadas por este parásito y cerca de 25 millones en riesgo de adquirir la infección. Su principal mecanismo de transmisión es la vía vectorial, que predomina en Latinoamérica, seguida de la transmisión oral; sin embargo, es posible detectar la infección en individuos de otras zonas como Estados Unidos, Canadá, Europa y algunos países del Pacífico Oeste, debido a la transmisión por otras vías (transfusional, congénita, posterior a los trasplantes), lo cual se relaciona con las migraciones humanas en zonas en las que no existe el vector (1-3).

Diagnóstico de la tripanosomiasis americana

El diagnóstico de la tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas se basa en un constructo de pruebas que incluye hallazgos clínicos, antecedentes epidemiológicos y exámenes de laboratorio; estos últimos son, sobre todo, pruebas parasitológicas y serológicas, según la fase de la enfermedad, siendo las pruebas parasitológicas útiles para el diagnóstico de la fase aguda y las serológicas, de la fase latente y crónica (4-6).

Pruebas parasitológicas directas

Las pruebas parasitológicas directas utilizadas son el examen directo de sangre fresca, el extendido de sangre periférica, la gota gruesa y las pruebas de concentración como el método de Strout y microhematocrito.

Examen directo de sangre fresca

Este examen rápido y sencillo permite visualizar al microscopio las formas tripomastigotas del parásito en movimiento en una gota de sangre entre lámina y laminilla.

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: lanceta estéril, gasa estéril, portaobjetos, cubreobjetos y solución salina al 0.85 % (ver anexo 1).

Procedimiento

1. Limpiar muy bien la zona de la que se va a extraer la sangre; por lo general, esta es el pulpejo del dedo de la mano. En caso de niños, también se puede tomar la muestra del dedo del pie o del lóbulo de la oreja.

2. Tomar una gota de sangre por punción con una lanceta estéril y descartar la primera gota de sangre.

3. Colocar la gota de sangre sobre un portaobjetos, agregar una gota de solución salina al 0.85 % y mezclar.

4. Colocar una laminilla y observar al microscopio con el objetivo de 40X.

El examen debe ser minucioso y se debe observar toda la muestra. Se puede hacer este mismo procedimiento con muestras de líquido pericárdico o líquido cefalorraquídeo (LCR). El examen se considera positivo al visualizar las formas tripomastigotas del parásito, generalmente en movimiento serpenteante entre los glóbulos rojos y los leucocitos. Si el examen es negativo, y ante la persistencia de sospecha clínica, debe realizarse un estudio seriado de nuevas muestras de sangre durante varios días.

Extendido de sangre periférica y gota gruesa

Para la realización tanto del extendido de sangre periférica como de la gota gruesa, se requiere una muestra de sangre capilar en un portaobjetos que será coloreada con una tinción derivada de Romanowsky (Wright, Field, Giemsa), previa a fijación con metanol.

Procedimiento para la toma de muestra

1. Tomar una muestra de sangre con una lanceta estéril en el pulpejo de algún dedo de la mano (o del pie, o del lóbulo de la oreja en el caso de los niños), previa asepsia y antisepsia de la zona. Descartar la primera gota de sangre.

2. Colocar una gota de sangre en el extremo de un portaobjeto para el extendido y dos o tres gotas a lo largo de otro portaobjetos para realizar la gota gruesa.

3. Para el extendido, es necesario esparcir la gota a lo largo del portaobjetos con ayuda del borde de otro portaobjetos en un ángulo de 30 ° o 40 °. Para las gotas gruesas, es necesario extender cada una de las gotas de sangre y formar un pequeño rectángulo, con ayuda de la esquina de un segundo portaobjetos, como se puede ver en la figura 2.1.

4. Dejar secar muy bien las láminas en un lugar libre de polvo antes de realizar la coloración.

Figura 2.1. Procedimiento para la realización del extendido de sangre periférica y la gota gruesa.

Fuente: elaboración propia.

El extendido de sangre periférica es una técnica poco sensible; sin embargo, se observa la morfología característica del parásito y se pueden identificar con claridad cinetoplasto, núcleo, flagelo y membrana ondulante.

Coloración para el extendido y gota gruesa

Materiales y reactivos

Los materiales y reactivos necesarios para esta técnica son: metanol, portaobjetos curvo para coloración, solución colorante de Giemsa (ver anexo 64), solución de agua amortiguada (ver anexo 65) y coloración de Wright (ver anexo 66).

Procedimiento para el extendido

1. Fijar el extendido de sangre periférica con unas gotas de metanol puro durante algunos segundos y dejar secar.

2. Mezclar dos gotas de solución colorante de Giemsa por cada mililitro de agua amortiguada.

3. Colocar la solución colorante antes preparada sobre el extendido fijado o proceder igual que en la gota gruesa.

4. Colorear a temperatura ambiente durante 20 minutos. Este tiempo puede variar según el lote de colorante empleado.

5. Lavar cuidadosamente con agua corriente (chorro suave).

6. Dejar secar y observar al microscopio de luz con el objetivo de inmersión 100X.

Las muestras también pueden ser teñidas con la coloración de Wright.

Procedimiento para la gota gruesa

Esta técnica, también utilizada para el diagnóstico de malaria, brinda la posibilidad de concentrar varias capas de sangre (de 20 a 30 en relación con el extendido). Por lo tanto, es más sensible que el examen en fresco y que el extendido de sangre periférica.

1. Mezclar una gota de solución colorante de Giemsa por cada mililitro de agua amortiguada.

2. Invertir la lámina sobre la solución colorante en un portaobjetos curvo para coloración, con el fin de permitir su deshemoglobinización y evitar la formación de burbujas (ver figura 2.1).

3. Colorear a temperatura ambiente durante 10 minutos. Este tiempo puede variar según el lote de colorante empleado.

4. Lavar cuidadosamente con agua corriente (chorro suave) por el reverso del portaobjetos.

5. Dejar secar y observar al microscopio de luz con objetivo de inmersión 100X.

Las muestras también pueden ser teñidas con la coloración de Wright.

Microhematocrito

Esta es una técnica de concentración de alta sensibilidad durante la fase aguda y se utiliza ampliamente en casos de tripanosomiasis congénita, porque requiere poca cantidad de sangre.

Procedimiento

1. Tomar una muestra de sangre en un capilar de microhematocrito con anticoagulante.

2. Centrifugar a 800 g y romper el capilar a nivel de la interfase leucoplaquetaria, es decir, entre los glóbulos rojos y glóbulos blancos.

3. Verter su contenido en un portaobjetos, cubrir con una laminilla y observar en un montaje directo o en fresco.

4. También es posible realizar un extendido y teñir con solución colorante o con la coloración de Wright, como se explicó en los apartes que se refieren al procedimiento para el extendido y la gota gruesa. Se deben buscar formas tripomastigotes en movimiento o coloreadas en la muestra en el portaobjetos.

Método de Strout

Este método es una de las técnicas más sensibles, con 90 % a 100 % de sensibilidad en fase aguda y 10 % en fase crónica, pero requiere de un volumen mayor de sangre (5-8).

Procedimiento

1. Tomar 10 ml de sangre por punción venosa en un tubo seco, dejando que el coágulo se forme y se retraiga.

2. Centrifugar a 800 g para eliminar los glóbulos rojos restantes.

3. Centrifugar a 500 g para concentrar los parásitos en el sedimento.

4. Hacer un montaje en fresco o teñir con solución colorante o coloración de Wright a partir de este sedimento, con el fin de observar las formas tripomastigotes.

Biopsia

La biopsia permite identificar los nidos de amastigotes del parásito en los tejidos (9).

Procedimiento

1. Realizar cortes histológicos y colorear con hematoxilina-eosina (10).

2. Observar los nidos de amastigotes de T. cruzi en tejidos como fibra cardiaca, ganglio linfático y cerebro.

Es posible, además, realizar una prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por su sigla en inglés) a partir de estas muestras para confirmar la presencia del parásito, a pesar de que no existan formas circulantes.