Kitabı oku: «Métodos analíticos de microbiología general y aplicada»

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Contenido

Prólogo

El presente documento es una versión mejorada y ampliada del Manual de prácticas de laboratorio: microbiología general y aplicada (2012), la cual incorpora nuevas unidades temáticas y la descripción gráfica de cada uno de los procedimientos abordados.

El texto de Métodos analíticos de microbiología general y aplicada es la herramienta de trabajo de laboratorio de las asignaturas de Microbiología General, Microbiología Agrícola, Microbiología Ambiental y Microbiología de Alimentos que se imparten en los programas académicos de Biología, Ingeniería Agronómica, Ingeniería Ambiental y Sanitaria e Ingeniería Pesquera de la Universidad del Magdalena.

La fundamentación teórica de los diferentes temas que se abordan en el presente texto permite tener una idea más clara de los propósitos y procedimientos de la microbiología en los distintos campos de aplicación. Por consiguiente, el estudiante podrá desarrollar competencias profesionales que le harán posible estudiar los microorganismos presentes en agua, suelos y alimentos, como también aprovechar su actividad metabólica en pro de solucionar problemas de ambientes contaminados.

Agradezco a la Universidad del Magdalena, en especial a la Vicerrectoría de Investigación, por hacer posible la publicación de esta obra en la Editorial Unimagdalena, contribuyendo al fortalecimiento de la academia y a la investigación de toda la comunidad universitaria que pueda hacer uso de este texto.

Alcances

Al finalizar cada sesión de laboratorio, el estudiante estará capacitado para:

•Reconocer, aislar e identificar diferentes microorganismos.

•Aplicar las técnicas y procedimientos para el análisis microbiológico en diferentes muestras.x

Normas de bioseguridad

1.Utilizar una bata de laboratorio, la cual debe colocarse antes de ingresar al laboratorio y deberá estar siempre abrochada.

2.Evitar el uso de sandalias o zapatos abiertos durante la realización del laboratorio, con el fin de prevenir accidentes mecánicos.

3.Evitar el uso de aparatos de distracción durante la realización de la práctica. Cuando se requiera la utilización de aparatos electrónicos como teléfonos celulares, esta deberá ser autorizada por el docente o encargado del laboratorio.

4.No se deben guardar ni consumir alimentos y bebidas dentro del laboratorio. No fumar.

5.Emplear guantes, gorros y tapabocas cuando en las prácticas sean requeridos.

6.La mesa debe estar libre de todo objeto no útil para desarrollar el trabajo, y al final debe dejarse limpia y libre de material o equipo ajeno a su funcionamiento normal.

7.Trabajar en la mayor parte posible bajo estrictas normas de asepsia.

8.Durante las prácticas se deberán mantener las más estrictas normas de esterilidad. Las asas de siembra deben ser esterilizadas a la llama del mechero antes y después de su uso.

9.Los cultivos microbianos deben manipularse al lado del mechero. Al extraer una muestra (inóculo) desde un tubo de ensayo, este deberá mantenerse en posición horizontal para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. Será preciso además flamear la boca del tubo a la llama del mechero antes y después de retirar el inóculo respectivo. Al retirar los tapones desde la boca del tubo, esto debe hacerse con ayuda de la palma de la mano y el dedo meñique. Por ningún motivo dejar el tapón de algodón sobre el mesón.

10.Esterilizar el material contaminado antes de desecharlo.

11.Depositar los desechos que se produzcan durante la práctica en las canecas respectivas según corresponda a material biológico (caneca roja), ordinario no reciclable (caneca verde), reciclable papel-cartón (caneca gris) y material reciclable plástico (caneca azul).

12.Marcar debidamente las muestras que representen un riesgo biológico. Así mismo, los cultivos de microorganismos deberán rotularse antes de llevarlos a incubar.

13.Lavarse las manos antes y después de concluir una práctica.

14.Informar inmediatamente cualquier accidente al encargado del laboratorio.

Glosario

Agar agar: sustancia solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de algunas especies de algas y que la mayoría de los medios de cultivos sólidos contienen. La palabra “agar” es utilizada comúnmente para llamar a los medios de cultivos sólidos.

Aislamiento: procedimiento mediante el cual se separan los microorganismos desde cualquier muestra o ambiente en un medio de cultivo.

Ambiente indoor: término que usualmente aplica al aire de ambientes interiores no industriales (colegios, clínicas, bibliotecas, restaurantes, oficinas, etc.) parcialmente cerrados.

Ambiente outdoor: término que se refiere al ambiente exterior (campo de fútbol, jardines, mercados, zonas industriales, rellenos sanitarios, etc.), es decir, ambientes no encerrados.

Antibióticos: sustancias producidas por algunas bacterias u hongos o fármacos sintéticos que inhiben o matan el crecimiento de los microorganismos.

Asas de siembra: instrumento elaborado en una mezcla de metales (platino, acero, aluminio y nicromo) que se emplea para transportar los inóculos y realizar las siembras de los microorganismos.

Asepsia: es la ausencia de microorganismos en ambientes, instrumentos de laboratorios y muestras biológicas. Esta se logra con un buen procedimiento de esterilización.

Batería bioquímica: es el conjunto de medios de cultivos o sustratos específicos que se emplean para la identificación bioquímica de las bacterias.

Caldo: medio de cultivo líquido.

Cepa: población de células genéticamente idénticas derivadas de una única célula. También se definen como el conjunto de especies bacterianas que comparten al menos una característica.

Colilert: es un sustrato definido empleado para la determinación de coliformes y Escherichia coli presentes en muestras de agua.

Colonias: conjunto de células microbianas formadas en la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias presentan variaciones en aspectos de la morfología como la forma, los bordes, la elevación, la textura y la coloración.

Contaminación: es la alteración de un cultivo puro microbiano por la presencia de otro microorganismo. También hace referencia a la presencia de microorganismos infecciosos en muestras de alimentos, medicamentos, agua para consumo y ambientes limpios.

Cultivo axénico: es un cultivo conformado por una sola especie proveniente de una sola célula bacteriana. Se puede decir que un cultivo axénico es un cultivo puro.

Cultivo mixto: es un cultivo conformado por dos o más células bacterianas de diferentes especies.

Desinfección: es el procedimiento físico o químico mediante el cual se busca eliminar o inactivar los microorganismos presentes en un área, superficie, objeto o instrumento. La desinfección se logra con el uso de sustancias químicas llamadas desinfectantes, como el alcohol antiséptico, solución de hipoclorito de sodio, peróxidos, yoduros, etc., que actúan de manera bacteriostática.

Diluciones seriadas: es un procedimiento mediante el cual se busca disminuir la concentración gradual de microorganismos presentes en una muestra. La dilución parte de un volumen conocido de la muestra (solución madre) y se lleva a un tubo de ensayo que contiene un volumen exacto de agua peptonada 0,1% o agua destilada estéril, y a partir de este se lleva a otro tubo con igual volumen hasta donde se logre definir la concentración más baja o concentración deseada.

Fermentación: es el proceso metabólico que realizan los microorganismos como bacterias y hongos en condiciones anaeróbicas. Consiste en transformar un compuesto orgánico, por ejemplo un azúcar (glucosa), en otro compuesto orgánico, como ácidos orgánicos (ácido fórmico, cítrico, succínico, etc.), alcoholes (butanol, etanol, etc.) y gases (CO2 y CH4).

Esterilización: es el proceso mediante el cual se matan o eliminan los microorganismos presentes en cualquier objeto o ambiente. La esterilización se realiza a través de mecanismos físicos como el tratamiento térmico con calor directo (fuego), calor húmedo (autoclaves) y calor seco (estufas); radiación (luz UV), filtración (filtros de 0,22-0,45 µm) y procedimientos químicos empleando reactivos como ácidos, alcoholes, aldehídos y fenoles.

Incubación: se refiere al proceso mediante el cual los organismos o microorganismos crecen bajo condiciones controladas de temperatura. Por lo general, la incubación de los cultivos bacterianos en el laboratorio se realiza a una temperatura de 35-37 °C durante 24 horas.

Infección: es la introducción y multiplicación de un microorganismo patógeno en un organismo huésped al cual le genera un daño o trastorno. Las infecciones pueden ser locales o sistémicas, causadas por bacterias, hongos, virus y protozoos.

Inóculo: suspensión de microorganismos presentes en una muestra biológica (tejidos, órganos, sustancias de secreción, etc.) o en muestras de alimentos, agua, suelos o ambientes. También se conoce como inóculo la pequeña cantidad de muestra que contiene los microorganismos que se depositan en un medio de cultivo o que son transferidos a un huésped.

Medios de cultivos: son preparados sólidos o líquidos estériles que contienen todos los nutrientes necesarios y en la cantidad adecuada para el desarrollo de los microorganismos.

Número más probable (NMP): técnica cualitativa que se emplea para estimar la densidad del crecimiento bacteriano. Se fundamenta en la determinación de la presencia o ausencia de diluciones consecutivas de características particulares de microorganismos presentes en muestras de agua o suelo.

Patógeno: agente biológico que tiene la capacidad de causar enfermedad o daño en un organismo huésped. Entre los microorganismos patógenos más agresivos se encuentran las bacterias, los virus y los hongos.

Sensidiscos: discos de papel que contienen un antibiótico de concentración conocida. Se emplean para determinar la sensibilidad o resistencia de un microorganismo frente a un antibiótico a través de técnicas semicuantitativas como los antibiogramas por difusión en agar por discos.

Tinción: es la acción de teñir las células microbianas mediante la aplicación de sustancias químicas conocidas como colorantes. Según la cantidad de colorantes que se emplean, las tinciones pueden ser simples o compuestas. Buscan dar realce y definición a la forma y agrupación de las células.

Torunda: herramienta que se emplea para la toma de muestras microbiológicas (inóculos) en organismos vivos o monitorear superficies planas e irregulares, como también para la realización de siembras masivas en placas de agar. Las torundas también se conocen como hisopos.

Siembras microbiológicas: procedimiento que consiste en introducir un inóculo en un medio de cultivo con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Las siembras se realizan con ayuda de un asa, a través de diferentes métodos como punción, estrías, extensión en superficie, etcétera.

Unidades formadoras de colonias (UFC): es la unidad de medida de la técnica de recuento directo en placa. Se emplea para contar el número de colonias de bacterias o células fúngicas aisladas a partir de muestras de suelo, agua o alimentos. Las UFC están conformadas por el número mínimo de células viables que dan lugar a una colonia que se obtienen de una serie de diluciones. Las UFC se miden en unidades de volumen (UFC/mL) o masa (UFC/g).

Xenobiótico: compuesto químico complejo que no existe en la naturaleza sino que ha sido diseñado por el hombre. Es de difícil degradación y tiende a permanecer mucho tiempo en el suelo o cuerpos de agua.

Elementos y equipos de uso frecuente en el Laboratorio de Microbiología

En esta sección se describen las herramientas de trabajo y los equipos de mayor uso en el Laboratorio de Microbiología, de manera que el estudiante pueda tener una idea clara sobre las funciones y el manejo de estos elementos (tabla 1).

Tabla 1. Descripción de elementos y equipos de mayor uso en el Laboratorio de Microbiología

Asa bacteriológica rectaSe utiliza para la toma de inóculos y posterior siembra en medios de cultivos sólidos en forma recta o inclinada (pico de flauta). Es el instrumento ideal para realizar siembras por punciones o picaduras.

Asa bacteriológica redondaSe utiliza para la toma de inóculos y posterior siembra en medios de cultivos líquidos y sólidos. Es el instrumento ideal para realizar siembras de estría por agotamiento. El aro debe estar completamente cerrado y no puede medir más de 3 mm de diámetro.

Asa de Digralsky Se emplea para extender las muestras sobre la superficie de una placa de Petri con medio de cultivo sólido. Puede ser en forma de L o triangular. Es muy útil para la obtención de colonias a través de la técnica del recuento directo en placa.

Asa fúngicaSe emplea para extraer las muestras de mohos presentes en muestras vegetales, como también para la toma de inóculos de cultivos fúngicos y llevarlos a placas con medio de cultivo a través de la siembra por punción.

Autoclave horizontal automáticoEquipo de esterilización automático. El proceso se da por acción de calor húmedo: al calentar el agua en la bóveda del equipo, se genera vapor a una temperatura de 121 °C y una presión de 15 lb. El ciclo de esterilización tarda quince minutos, destruyendo las células microbianas vegetativas y esporas de resistencias.

Autoclave tipo olla semiautomáticoEsterilizador eléctrico a vapor. El proceso se da por acción de vapor a una temperatura de 121 °C y 15 lb de presión durante quince minutos.

Balanza analíticaLa balanza es el instrumento que mide la masa de una muestra expresada en kilogramos, gramos o miligramos. Es útil en el laboratorio de microbiología para pesar medios de cultivos, reactivos y muestras de alimentos y suelo.

Bandeja Quanti-TrayEstas bandejas son útiles en los análisis microbiológicos del agua por la técnica del sustrato definido Quanti-Tray. Contienen 48 pozos grandes y 48 pozos pequeños, donde queda depositado el volumen de agua que se va a analizar.

Baño de MaríaEste equipo se emplea para el calentamiento uniforme de algunas muestras de alimentos, como también para temperar o disolver sustancias nutritivas como los medios de cultivos y algunas tinciones.

BeakerBeaker o vaso de precipitado. Son recipientes de vidrio con forma cilíndrica de diferentes volúmenes que se emplean para la preparación y calentamiento de sustancias.

Cabina de flujo laminarEs un equipo que contiene un filtro y un ventilador que genera un flujo o corriente de aire que aspira todas las partículas de hasta 0,1 micras. Es ideal para realizar aislamientos microbianos y dispensar medios de cultivos estériles.

Campana DurhamEs un tubo pequeño que se emplea para evidenciar la producción de gas derivada de una fermentación. Las campanas Durham se colocan de manera invertida dentro de un tubo de ensayo que contiene un medio de cultivo líquido.

CubreobjetosEs una lámina fina de vidrio. Generalmente, miden 20 mm x 20 mm y se emplean para cubrir las muestras microscópicas que se encuentran encima de un portaobjeto.

CuentacoloniasEs un equipo que permite estimar la densidad de colonias en una placa. Contiene una lupa y una cuadrícula que facilitan el conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC).

Equipo de filtración de membranaSe emplea para los análisis bacteriológicos del agua mediante la técnica de filtración por membrana. A este equipo se le coloca un filtro estéril de 0,45 micras y se conecta a una bomba de vacío que genera el filtrado de manera rápida. En el filtro quedan retenidas las células bacterianas, si están presentes. También se emplea para la esterilización de medios de cultivos líquidos que contienen sustancias nutritivas como vitaminas, proteínas y aminoácidos.

ErlenmeyerEs un recipiente de vidrio que puede medir diferentes volúmenes. La parte basal tiene forma de cono, mientras que la parte superior tiene forma de cuello cilíndrico para evitar pérdida de evaporación. Se emplea para preparar y calentar medios de cultivos y soluciones nutritivas.

EstereoscopioEs un equipo óptico que permite la observación tridimensional de muestras vegetales o fúngicas y de organismos pequeños. En este equipo se pueden manipular las muestras a través de agujas de disección o realizar cortes de estructuras.

Frasco tapa roscaEs un frasco de vidrio adaptado para medir volúmenes exactos de sustancias químicas o medios de cultivos. También son útiles para la toma de muestras de agua para análisis microbiológicos.

GradillaLas gradillas son necesarias para colocar o sostener los tubos de ensayo que se emplean en las prácticas de laboratorio.

Guardián de seguridadEs un recipiente de bioseguridad donde se depositan todos los elementos cortopunzantes (agujas, lancetas, cuchillas de bisturí, etc.) que han sido utilizados para la toma de sangre o fluidos corporales. Estos desechos representan un riesgo biológico si no se tratan con extrema seguridad.

Horno PasteurEs un equipo automático que genera aire caliente o calor seco. Se emplea para la esterilización de materiales de vidrios, porcelana y elementos metálicos a una temperatura superior a 150 °C durante un tiempo de 1-2 horas. Todos los materiales que se esterilizan en el horno deben ir envueltos en papel kraft.

IncubadoraEs un equipo que permite el crecimiento y desarrollo de los cultivos bacterianos y fúngicos debido a que mantiene las condiciones óptimas de temperatura, humedad y oxígeno.

Jarra de GasPakLa jarra de GasPak o jarra de anaerobiosis es un recipiente que se emplea para realizar cultivos bacterianos en condiciones anaeróbicas. En el interior de la jarra se coloca un sobre que al reaccionar con agua genera H2 y CO2, dejándolo sin oxígeno. Como control se coloca una cinta de papel impregnada de azul de metileno (azul en presencia de oxígeno, incoloro en ausencia de oxígeno).

Mechero BunsenEl mechero Bunsen, al generar calor, es empleado para esterilizar asas bacteriológicas y pinzas metálicas. Así mismo, los procedimientos de siembra y aislamiento de microorganismos se realizan cerca de la llama del mechero con el fin de evitar contaminación.

MicropipetasSe emplean para succionar y transportar pequeños volúmenes de sustancias o muestras líquidas durante los procedimientos analíticos. Son de volúmenes variables y se identifican por un color (azul para volúmenes de 100-1.000 µL y amarillo para 20-200 µL).

MicroscopioEquipo óptico que se emplea para observar y detallar los organismos de tamaño muy pequeño. En el microscopio se observan bacterias, hongos, protozoos y microalgas a través de preparaciones frescas o tintoriales.

MorterosEs un recipiente que se emplea para macerar y homogenizar muestras sólidas como alimentos o suelo.

NeveraEquipo de refrigeración donde se preservan los cultivos microbianos puros. Asimismo, en las neveras se guardan los medios de cultivos estériles y sustancias que necesitan refrigerarse.

pH-metroEquipo que se emplea para medir el pH de las sustancias o muestras líquidas. La medición se hace a través de un sensor ubicado en una celda que contiene un par de electrodos, los cuales se introducen en la solución a la cual se le quiere medir el pH.

PipetasSe emplean para medir el volumen exacto de sustancias o muestras líquidas. Pueden ser de vidrio o plástico, de diferentes volúmenes, y deben estar esterilizadas para el desarrollo de los análisis microbiológicos.

Placas de PetriSon recipientes de vidrio o plástico que se emplean para el cultivo de microorganismos una vez se cubren con un medio de cultivo en condiciones estériles. Se recomienda que la placa se mantenga boca abajo debido a que al realizar los cultivos se produce vapor de agua, producto del metabolismo de los microorganismos; de esta manera se evita que caiga agua sobre la superficie del medio y así las colonias pueden mantenerse fijas al medio de cultivo.

PortaobjetosSon láminas de vidrio de forma rectangular que se emplean para la preparación y fijación de muestras biológicas que se observarán en el microscopio. Por lo general, a las muestras se les coloca un cubreobjeto con el propósito de fijarlas.

ProbetasEs un recipiente de forma cilíndrica que puede ser de vidrio o plástico. Es empleado para medir volúmenes aproximados de sustancias o muestras líquidas.

Sellador Quanti-TrayEs un equipo que trabaja con un sensor o rodillo calentado que se emplea para sellar y fijar la bandeja Quanti-Tray. En el momento de introducir la bandeja Quanti-Tray en el sellador, este distribuye de manera homogénea la muestra de agua en los pozos grandes y pequeños de la bandeja.

Tórulas o hisoposEs un instrumento que se emplea para recoger muestras biológicas como algunos fluidos corporales o flujo bucofaríngeo, como también para tomar muestras biológicas adheridas a superficies. Las tórulas suelen ser empleadas para realizar siembras masivas en placas de Petri con medio de cultivo, y siempre deben estar estériles.

Tubos de ensayoSon tubos cilíndricos de vidrio o plástico que pueden ser de diferentes tamaños o volúmenes. En microbiología se utilizan para el cultivo de microorganismos en medios líquidos o sólidos inclinados.

VórtexEs un equipo agitador de forma orbital, en el que se colocan frascos o tubos de ensayo que contienen muestras líquidas o en suspensión que se requiere homogenizar. Los vórtex se ajustan a velocidades entre 100 y 3.200 rpm y pueden ajustarse a una sola velocidad estándar.

I. Examen microscópico bacteriano (morfología y tinciones)
Introducción

Los microorganismos se encuentran presentes en una amplia variedad de hábitats y sustratos (vegetales, animales, suelo, agua, etc.). Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, no se pueden ver a simple vista; solo es posible observarlos mediante un examen microscópico, el cual se realiza frotando la muestra biológica en una lámina portaobjeto y contrastándola con un colorante. Básicamente, se realizan dos tipos de exámenes microscópicos: el de microorganismos vivos y el de microorganismos muertos (Valenzuela, 2007). En esta práctica de laboratorio nos centraremos en el estudio de microorganismos muertos procedentes de cultivos bacterianos existentes en el laboratorio.

Examen microscópico de microorganismos muertos

Se realiza mediante la observación microscópica de preparaciones fijadas y teñidas, las cuales ofrecen tres ventajas principales para la observación: 1) aumentan el contraste entre la célula bacteriana y el medio que la rodea, 2) permiten distinguir diferentes tipos de células bacterianas según sea su capacidad de teñirse con cualquier colorante (como por ejemplo las tinciones de Gram y Ziehl-Neelsen), y 3) permiten establecer la morfología de la célula bacteriana y de otros microorganismos, su agrupación y también algunas estructuras específicas (Valencia, 2004). Este tipo de preparaciones se basa en los siguientes procedimientos: extensión, fijación y tinción.

•Extensión: consiste en depositar asépticamente, en el centro de un portaobjeto, una gota de agua destilada y, con ayuda del asa de siembra, extraer el inóculo desde un cultivo bacteriano. Luego con el asa estéril se procede a expandir el inóculo junto con la gota de agua sobre la superficie del portaobjeto de manera que quede uniformemente repartida.

•Fijación: después de extendidas, las células bacterianas se deben adherir al portaobjeto en el cual se van a teñir. Para el caso de las bacterias, la fijación por calor es lo más común (método físico a través de la llama del mechero), pero también se recurre a compuestos químicos como formaldehído, ácido fénico, alcoholes, etc. (método químico). En esta práctica utilizaremos el calor para matar las bacterias y adherirlas al portaobjeto.

•Tinción: una vez fijada la muestra, se procede a su tinción, para lo cual se hace uso de colorantes. La mayoría de ellos son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por componentes celulares. Muchos de los colorantes utilizados corresponden a moléculas cargadas positivamente (colorantes catiónicos) como azul de metileno, cristal violeta o safranina, y se combinan con gran afinidad con constituyentes celulares cargados negativamente, tales como ácidos nucleicos y polisacáridos. También existen colorantes aniónicos (moléculas cargadas negativamente), como la eosina, que se combinan con componentes celulares cargados positivamente como proteínas. Un tercer grupo de colorantes está formado por compuestos que se combinan con los materiales lipídicos de las células y son utilizados para localizar depósitos de grasa; por ejemplo, el colorante negro de Sudán (López-Jácome, et ál., 2014).

Existen sustancias químicas denominadas mordientes, que son capaces de combinarse con algún constituyente celular y alterarlo de tal forma que sea más vulnerable a un colorante, de manera que algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con esta sustancia. Los mordientes no son colorantes por sí mismos, y algunos ejemplos de estas sustancias son el ácido fénico y el ácido tánico (Arias y Gómez, 2001).

Mediante las tinciones especiales se pueden determinar morfología, agrupación, flagelos, endosporas, etc. Aun así, es preciso tener en cuenta que todos los métodos de tinción deberán usarse con precaución ya que pueden conducir a errores debido a que las moléculas de colorantes forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones artificiales inducidas por el propio colorante.

Tipos de tinciones

Según el número de colorantes utilizados, las tinciones se pueden agrupar en dos categorías: tinciones simples (en las cuales se emplea un solo colorante) y tinciones compuestas o diferenciales (en las que se emplea más de un colorante).

•Tinción simple: consiste en la aplicación de un solo colorante al extendido previamente fijado, con lo cual se aumenta el contraste de las células para poder observarlas claramente. Uno de los colorantes más indicados es el azul de metileno, que actúa rápida y suavemente sobre todas las células bacterianas y no oscurece los detalles celulares. Además, es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe (Gamazo, et ál., 2005). La tinción simple tiene como objetivo determinar la morfología y agrupación que presentan las bacterias (figura 1).

•Tinciones compuestas o diferenciales: son aquellas en la que se emplea más de un tipo de colorante, por lo que todas las células de la muestra no quedan teñidas iguales. Esto permite poner en evidencia, aparte de la morfología de los microorganismos y su agrupación, algunas estructuras como endosporas, flagelos, depósitos de grasas y la reacción de las bacterias frente a un colorante específico. En esta guía de práctica se realizarán las tinciones diferenciales de Gram, Writz y Ziehl-Neelsen:

•Tinción de Gram: el organelo responsable de la tinción de Gram es la pared celular. La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro según la tinción introducida por Christian Gram (1884) es una característica taxonómica importante con la que se correlacionan también otras propiedades de las bacterias. Este procedimiento se inicia con una tinción de las células bacterianas fijadas mediante el colorante básico cristal violeta. A continuación se trata con una solución de yodo (lugol), el cual forma una laca con el cristal violeta, que es insoluble en agua y solo medianamente soluble en alcohol o acetona. Las células se tratan después con alcohol acetona, de modo que las células Gram positivas retienen el complejo colorante-yodo y quedan azules, y las células Gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona. Estas últimas se hacen visibles mediante una coloración de contraste con otro colorante como la fucsina o safranina (Schlegel, 1997). La tinción de Gram tiene como objetivo identificar la morfología de las células bacterianas, su agrupación y la reacción al Gram (Gram positiva o Gram negativa).

•Tinción de Wirtz: esta tinción permite colocar en evidencia las endosporas bacterianas, cuyos constituyentes químicos son capaces de retener fuertemente el colorante verde de malaquita al 7,6%, adquiriendo el color de éste, mientras que el resto de la célula bacteriana se tiñe del color del colorante de contraste utilizado. La tinción de Wirtz tiene como objetivo determinar la presencia de las endosporas, aparte de observar la morfología de la célula y su agrupación.

•Tinción de Ziehl-Neelsen (ZN): esta tinción fue instituida por el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen. Principalmente se emplea para aquellas bacterias difíciles de teñir como las del género Mycobacterium también conocidas como bacterias ácido-alcohol resistentes (AAR). En esencia son bacterias Gram positivas, pero no retienen el colorante cristal violeta debido a que tienen una pared muy gruesa hidrofóbica, cerosa y rica en ácidos micólicos, lo cual les confiere resistencia a muchos colorantes. La tinción utiliza el colorante fucsina fenicada (colorante primario), el cual debe aplicarse en condiciones de calor, pero sin dejar secarlo con el fin de que penetre la pared celular de las bacterias. Posteriormente, se aplica una mezcla de ácido y alcohol (decolorante), y por último, el colorante de contraste (azul de metileno). Las células ácido-alcohol resistentes permanecen teñidas de fucsia ya que retienen el primer colorante, mientras que las no resistentes se decoloran con el ácido-alcohol y se teñirán de azul con el colorante de contraste (Gamazo, et ál., 2005). La tinción NZ tiene como objetivo determinar la resistencia al alcohol ácido, aparte de la morfología y agrupación de las células bacterianas.

Figura 1. Morfología y agrupación de las células bacterianas.

Objetivo

El estudiante deberá, a partir de cada una de las tinciones que realice, determinar la morfología de las células bacterianas y su agrupación y observar endosporas. Así mismo estará en capacidad de identificar la reacción a la tinción de Gram y Ziehl-Neelsen.

Materiales

•Cultivo de Escherichia coli.

•Cultivo de Klebsiella pneumoniae.

•Cultivo de Staphylococcus aureus.

•Cultivo de Bacillus cereus.

•Cultivo de Mycobacterium sp.

•Láminas portaobjetos.

•Asas de siembra.

•Solución de azul de metileno.

•Solución de violeta de genciana.

•Solución cristal violeta.

•Lugol.

•Alcohol acetona.

•Solución de fucsina.

•Solución de safranina al 0,25%.

•Solución de verde de malaquita al 7,6%.

•Solución de fucsina fenicada.

•Ácido-alcohol.

•Rejillas para tinción.

•Bandejas.

•Frascos lavadores con agua.

•Toallas de papel absorbente.

•Aceite de inmersión.

•Microscopios.

•Mecheros.

•Fósforos.

Procedimiento
Preparación del frotis bacteriano (figura 2)

—Tome varios portaobjetos y, con ayuda de un marcador permanente de punta fina, trace pequeños espacios, los cuales serán utilizados para el rotulado de las preparaciones microscópicas.

—Deposite 1 ó 2 gotas de agua destilada en los espacios delimitados para los extendidos de los inóculos.

—Con ayuda del asa de siembra, previamente esterilizada en la llama del mechero, extraiga asépticamente una porción de la colonia bacteriana que se encuentra en los cultivos (S. aureus, E. coli, B. cereus, Mycobacterium tuberculosis) y deposítela en el centro del portaobjeto junto con las gotas de agua destilada.

—Extienda la porción de la colonia con la gota de agua en el portaobjeto utilizando el asa de siembra. Realice círculos sucesivos en el portaobjeto hasta cubrir todo el espacio delimitado para el extendido.

—Fije el extendido. Para esto deberá pasarlo por la llama del mechero levemente.

—­Realice todos los frotis bacterianos para las diferentes tinciones.

Figura 2. Procedimientos para la obtención de un frotis bacteriano.

Tinción simple (figura 3)

—Tome los portaobjetos que contienen los frotis destinados para la tinción simple. Para este caso se recomienda trabajar con los frotis de las bacterias S. aureus y B. cereus.

—Deposite ahora los portaobjetos en la rejilla y proceda a teñirlos agregando sobre las muestras el colorante azul de metileno o violeta de genciana. Déjelos actuar por un minuto.

—Elimine el colorante y lave con agua. Seque con papel absorbente presionando suavemente los portaobjetos y luego exponiéndolos suavemente a la llama del mechero.

—Observe las preparaciones al microscopio, primero con los objetivos de menor aumento (10X, 40X), agregue una gota de aceite de inmersión y enfoque con el objetivo de inmersión (100X).

—Identifique la morfología y agrupación de las bacterias observadas y esquematícelas.

—Terminada la observación, elimine las preparaciones en la bandeja.

Figura 3. Procedimientos básicos para la tinción simple.

Tinción de Gram (figura 4)

—Tome los portaobjetos que contienen los frotis destinados para la tinción de Gram. Para este caso se recomienda trabajar con los frotis de las bacterias E. coli, S. aureus y B. cereus.

—Deposite ahora los portaobjetos con su muestra fijada sobre la rejilla.

—Tiña con cristal violeta durante un minuto.

—Elimine el colorante y lave suavemente con agua.

—Aplique lugol (mordiente) durante un minuto.

—Elimine el lugol y lave con agua.

—Decolore con una solución de alcohol-acetona durante 10-30 segundos (el tiempo dependerá del grosor del frotis).

—Elimine el alcohol-acetona y lave con agua.

—Tiña con fucsina o safranina (contraste) por un minuto.

—Elimine el colorante de contraste y lave con agua.

—Seque con papel absorbente presionando suavemente los portaobjetos y luego expóngalos de forma muy suave a la llama del mechero.

—Observe las preparaciones al microscopio, primero con los objetivos de menor aumento (10X, 40X) y busque la zona donde depositó la muestra. Una vez logrado esto, enfoque con el objetivo de inmersión (100X) tal como lo hizo en la tinción simple.

—Termine la observación identificando la morfología, la agrupación y la reacción al Gram de las bacterias observadas y esquematícelas.

—Elimine las preparaciones en la bandeja.

Figura 4. Pasos de la tinción de Gram.

Tinción de Wirtz (figura 5)

—Tome el portaobjeto que contiene el frotis para la tinción de Wirtz. Para este caso se trabajará con el extendido de la bacteria B. cereus.

—Deposite ahora el portaobjeto con su muestra fijada sobre la rejilla.

—Tiña de 6 a 8 minutos con verde de malaquita al 7,6% con calor del mechero y sin dejar secar el colorante.

—Elimine el colorante y lave con agua por 10 a 15 segundos.

—Tiña con una solución al 0,25% de safranina por quince segundos.

—Elimine la safranina y lave con agua.

—Seque con papel absorbente presionando suavemente el portaobjeto y luego expóngalo de forma muy suave a la llama del mechero.

—Observe con el objetivo de inmersión (100X) como de costumbre.

—Identifique las esporas bacterianas de manera libre (exosporas) o en su defecto las endosporas. Esquematice lo observado.

—Terminada la observación, elimine la preparación en la bandeja.

Figura 5. Procedimientos de la tinción de Wirtz.

Tinción de Ziehl-Neelsen (figura 6)

—Tome el portaobjeto que contiene el frotis para la tinción de Zielh-Neelsen. Para este caso se trabajará con el extendido de la bacteria M. tuberculosis.

—Deposite ahora el portaobjeto con su muestra fijada sobre la rejilla.

—Cubra la preparación con fucsina fenicada y deje actuar por cinco minutos con calor del mechero hasta desprender vapores, pero sin dejar secar el colorante.

—Elimine el colorante y lave con agua de 10 a 15 segundos.

—Decolore con alcohol ácido durante 10-20 segundos.

—Elimine el alcohol ácido y lave con agua.

—Tiña con azul de metileno como colorante de contraste durante 2 minutos.

—Elimine el colorante y lave con agua de 10 a 15 segundos.

—Seque con papel absorbente presionando suavemente el portaobjeto y luego expóngalo de forma muy suave a la llama del mechero.

—Observe con el objetivo de inmersión (100X) como de costumbre.

—Identifique las células bacterianas AAR teñidas de color fucsia y esquematícelas.

—Terminada la observación, elimine su preparación en la bandeja.

Figura 6. Pasos de la tinción de Zielh-Neelsen.

Complete las siguientes tablas de acuerdo con las tinciones realizadas:

Preguntas complementarias

1.¿Cuáles son los dos propósitos de la fijación por calor?

A.

B.

2.¿Por qué los colorantes básicos son más apropiados para teñir bacterias que los colorantes ácidos?

3.¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram?

4.¿Qué son bacterias Gram variables? Cite tres ejemplos.

II. Medios de cultivos
Introducción

En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas muy variadas y diferentes. La Microbiología se ha podido desarrollar debido a la posibilidad de estudiar especies aisladas de microorganismos, gracias a la aplicación de los medios de cultivos.

Existen y se utilizan una gran variedad de medios de cultivos cuya composición varía de acuerdo con las necesidades nutricionales de los organismos que se pretende estudiar. Así, el trabajo de aislamiento en cultivo puro de una especie dada puede facilitarse con ayuda de medios de cultivos que aprovechan alguna característica particular para sus exigencias nutricionales, aparte de considerar otros requerimientos como la temperatura, el oxígeno, el pH, etc. (Gómez y Batista, 2006).

Los medios de cultivos se definen como cualquier preparado, sólido o líquido, que contiene todas las sustancias nutritivas para el desarrollo de los microorganismos. Este debe ser estéril, tener un pH adecuado y estar protegido de la contaminación ambiental (Valenzuela, 2007).

En general, todo medio de cultivo debe contener los siguientes grupos de nutrientes:

•Fuente de hidrógeno: constituye la fuente de energía. Generalmente, es un azúcar que funciona a la vez como carbono.

•Aceptores de hidrógeno: son indispensables para aquellos microorganismos que no ocupan el oxígeno en la respiración y para aquellos microorganismos fermentadores que no utilizan sus propios metabolitos como aceptor de hidrógenos.

•Fuente de carbono: todos los microorganismos necesitan una fuente de carbono; algunos utilizan el CO2 del aire (autótrofos), pero la mayoría de las bacterias utiliza compuestos orgánicos carbonados preformados (organótrofos).

•Fuente de nitrógeno: es esencial para todos los organismos. Algunos lo requieren como compuesto orgánico, y otros pueden utilizar compuestos inorgánicos. Un pequeño grupo puede utilizar el nitrógeno atmosférico; por ejemplo, Azotobacter.

•Sales minerales: aportan elementos tales como azufre, fósforo y algunos activadores enzimáticos presentes en las coenzimas de los citocromos y en las peroxidasas (oligoelementos: Ca2+, Mg2+, Fe2+, Co2+, Mn2+, Cu2+, etc.). Todos los microorganismos necesitan aporte de sales minerales para su desarrollo.

•Factores de crecimientos: un factor de crecimiento es un compuesto orgánico (aminoácidos y bases nitrogenadas) que una célula debe tener para su crecimiento pero que ella misma no es capaz de sintetizar.

Clasificación de los medios de cultivos

Los medios de cultivos se han clasificado en forma artificial de acuerdo con su estado físico, composición química y utilización, solo para fines de ordenamientos.

Según su estado físico, los medios se clasifican en:

•Medios líquidos: comúnmente llamados caldos. Se emplean para la homogenización de muestras, realizar diluciones y enriquecimiento del medio de cultivo. Así mismo, son útiles para la activación de cepas microbianas liofilizadas. Por lo general, estos medios suelen servirse en tubos de ensayos o en matraces cuando se requiere analizar grandes cantidades de muestras (figura 7). Ejemplos: caldo peptona, caldo infusión cerebro corazón, caldo lactosado, caldo brila, etcétera.

Figura 7. Medios de cultivos líquidos. a)Caldo lactosado, b) Caldo brila, c) Caldo Salmosyst.

•Medios sólidos: se conocen como agares. Se obtienen a partir de medios de cultivos líquidos a los cuales se les agrega una sustancia solidificante, como por ejemplo agar-agar, gelatina o gel de sílice (los agares no deben confundirse con el agar-agar; este último es solo un agente solidificante y no brinda condiciones nutricionales). Los agares son empleados frecuentemente en placas de Petri o en tubos de ensayos de manera inclinada (figura 8), y son útiles para el aislamiento de microorganismos a través del desarrollo de colonias y mantenimiento de cultivos puros. Ejemplo: agar peptona, agar SPC, agar EMB, agar SS, agar sal manitol rojo de fenol, etcétera.

Figura 8. Medios de cultivos sólidos. a) Agar SS, b) Agar Baird Parker, c) Agar sangre, d) Agares LIA, TSI y citrato en forma inclinada.

•Medios semisólidos: tienen una consistencia sólida leve o gelatinosa. Provienen de medios de cultivos líquidos a los cuales se les ha adicionado una pequeña cantidad de agar-agar (0,4-0,8%). Por lo general, se usan tubos de ensayo y se emplean para determinar la movilidad de bacterias (figura 9). Ejemplo: agar SIM, agar MIO, etcétera.

Figura 9. Medios de cultivos semisólidos agar SIM. a) Observación de crecimiento bacteriano en todo el medio (móvil), b) Observación de crecimiento bacteriano solo en la línea de inoculación (inmóvil).

Fuente: Benadof (2008).

Según la composición química, los medios se clasifican en:

•Medios sintéticos o artificiales: se preparan a partir de ingredientes químicamente definidos, conociéndose exactamente su calidad y cantidad, y se utilizan en estudios de metabolismo. Ejemplo: agar nutritivo, agar TCBS, agar XLD, etcétera.

•Medios naturales: se desconoce su composición exacta. Se preparan a partir de hidrolizados, extractos de células o tejidos (ejemplo: extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc.). Son de uso común en los laboratorios de rutina y también se pueden adquirir como productos comerciales, deshidratados, elaborados por laboratorios. Ejemplo: agar peptona, agar sangre, agar papa dextrosa, agar zanahoria, etcétera.

Según la utilización, los medios se clasifican en:

•Medios comunes o básicos: son aquellos en los cuales crecen gran número de especies bacterianas poco exigentes nutricionalmente. Ejemplo: caldo común, agar peptona.

•Medios enriquecidos: son medios de cultivos comunes a los que se les agregan ciertos ingredientes que enriquecen su condición nutritiva original. Se emplean para el aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes o injuriados. Ejemplo: agar sangre, que está constituido de agar peptona más 5% de sangre desfibrinada; el caldo glucosado, que es caldo de peptona enriquecido con 1% de glucosa.

•Medios selectivos: son aquellos medios que han sido formulados químicamente de tal forma que favorecen el crecimiento de la especie que se desea aislar y al mismo tiempo suprimen el de cualquier otra especie competidora. Se preparan incluyendo generalmente algunas sustancias inhibidoras como antibióticos, sales biliares, etc. Ejemplos: agar SS, agar EMB (que al mismo tiempo son medios diferenciales).

•Medios diferenciales: son aquellos que favorecen el aislamiento de una especie dada a partir de un cultivo mixto, permitiendo reconocerla o detectarla a través de una característica bioquímica de valor taxonómico que le es propia: por ejemplo, la hemólisis de glóbulos rojos (en agar sangre), la coagulación del plasma, la fermentación de azúcares a través de cambios de pH que se detectan en el medio (que contienen un indicador de pH adecuado, como azul de bromotimol, rojo fenol, etcétera).

Las entidades comerciales de medios de cultivos como Merck, Oxoid, BBL, Difco, Scharlau, 3M, entre otras, han logrado desarrollar una variedad de medios de cultivos, facilitando el estudio de los microorganismos cultivables desde sus características nutricionales, fisiológicas, bioquímicas, serológicas y moleculares.