Kitabı oku: «Técnicas de análisis de imagen, (2a ed.)»

1. La imagen

El hombre, como el resto de los primates, es un animal eminentemente visual. Este hecho ha sido esencial en el desarrollo de nuestra especie, porque nos ha llevado a que nos valgamos de la imagen como elemento primordial para relacionarnos con nuestro entorno. La imagen es un pilar fundamental en las relaciones con nuestros semejantes, de manera que la mayor parte de la información del mundo la recibimos por medio del sentido de la vista.

Hasta tal punto somos animales visuales que hemos llenado el lenguaje coloquial de expresiones referidas al uso de este sentido. Desde el clásico aforismo que dice que «una imagen vale más que mil palabras», hasta giros como «no lo veo claro» u otros como «¿lo ves?» o «se le ve venir», son alusiones metafóricas a la relación que encontramos entre la comprensión de una situación y la percepción visual.

Y si la imagen es esencial en la vida cotidiana, no digamos cuánto lo es en la investigación científica. También la ciencia apoya su trabajo en las imágenes y es posible que la biología, en especial, sea una de las materias que genere mayor cantidad de imágenes. La observación minuciosa y el análisis de estas imágenes son la base de la actividad científica que permite obtener información para plantear hipótesis y comprobarlas.

¿Cómo nos enfrentamos a la información visual? Toda imagen que percibimos es analizada por el cerebro de manera automática. El análisis aporta gran cantidad de información porque el cerebro, trabajando de forma comparativa, permite reconocer y clasificar objetos de muy diversa complejidad; reconocemos letras en un texto, la marca y el modelo de un coche o los rostros de otros miembros de nuestra especie. Este análisis nos da idea del aspecto, forma, textura, distancia, velocidad relativa, tipo de movimiento y otras particularidades ligadas a los objetos contenidos en las imágenes. Esta capacidad humana es, hoy por hoy, inalcanzable para cualquier máquina, ordenador o sistema informático, por muy complejo que sea. Ninguna máquina tiene la capacidad del cerebro humano para clasificar objetos; ni siquiera muchos otros animales son capaces de competir con el sistema binario humano ojo-cerebro, ya que aquellos son incapaces de reconocer a sus propios congéneres.

La fantástica capacidad de clasificación de nuestro cerebro se basa, fundamentalmente, en la comparación de las imágenes. Nuestro análisis es cualitativo y casi inmediato. Si en una reunión de amigos alguien nos presenta a otra persona, inmediatamente sabemos, mirando únicamente su cara, si se trata de un hombre o una mujer; somos capaces de clasificar rápidamente el sexo de nuestros congéneres (muy pocas veces erramos) comparando el nuevo rostro con los rostros de nuestros conocidos, y extrayendo de inmediato el estereotipo «sexo al que pertenece». Los detalles comparativos en los que basamos nuestra clasificación son muy sutiles y vagos, pero lo suficientemente claros para proporcionarnos un altísimo índice de certeza, excepto en ciertas situaciones en las que el patrón se hace difícil de aplicar y se nos plantean serias dudas ante un rostro indefinido como el de un niño.

Ahora bien, el cerebro humano no es muy bueno cuando se trata de realizar un análisis cuantitativo de la imagen. Si se nos presenta un grupo de personas de pie, no tendremos demasiados problemas en ordenarlos por altura, pero tendremos ciertas dificultades para calcular la altura de uno en particular, incluso teniendo delante una referencia de longitud. Sin embargo este tipo de cuantificaciones es muy corriente en la tarea científica básica y es aquí donde los ordenadores pueden ser de mucha utilidad, en especial cuando se precisa automatizar una tarea de cuantificación para hacerla repetitiva. Y, simplemente, en eso consiste el análisis de imagen.

Ciertamente, un equipo de análisis de imagen puede identificar y clasificar objetos, pero el procedimiento que utiliza en esta operación es, precisamente, el opuesto al que utiliza nuestro cerebro: mientras que el cerebro clasifica sin medir, por comparación del problema actual con los datos acumulados con ante-rioridad, el equipo de análisis de imagen mide primero, obtiene datos numéricos de la morfología (área, perímetro, longitud, anchura) y las características ópticas (color, densidad óptica) y, en función de esos parámetros, clasifica los objetos.

1.1 Análisis de imagen y procesado de imagen

El término «análisis de imagen» hace referencia al estudio realizado sobre la imagen con el fin de obtener información de ella. En principio, no se trata de obtener específicamente datos cuantitativos o cualitativos. Pero, dado que para nosotros es más complicado apreciar las dimensiones de las cosas y que nos es más costoso medir un objeto que recordar su forma, el tiempo ha ido relacionando casi unívocamente el término «análisis de imagen» con la obtención de información cuantitativa.

Así pues, se podría definir nuevamente el término de análisis de imagen como un «proceso» mediante el cual se extrae información cuantitativa de la imagen. Por otra parte, esta definición no implica que el proceso deba realizarse de una manera especial; simplemente se extrae información cuantitativa de la imagen. La obtención manual de un dato a partir de una fotografía utilizando una regla o un pie de rey también es un análisis de imagen. Sin embargo, tal y como hoy en día es entendido, el análisis de imagen es un proceso llevado a cabo por un sistema informático, capaz de extraer de forma casi instantánea toda la información relevante contenida en una imagen determinada.

Deberíamos hacer una matización ahora que hemos introducido el ordenador digital como herramienta primordial en análisis de imagen porque se tiende a confundir el concepto de análisis de imagen con el de procesado de la imagen. La diferencia queda bien patente en la definición apuntada más arriba: un analizador de imagen siempre cuantifica y, por lo tanto, el resultado del análisis de imagen siempre es una tabla de datos, una gráfica o cualquier representación de los datos numéricos. El procesado de imágenes, sin embargo, siempre produce otra imagen como resultado de la operación; en este caso se pretende, por lo general, mejorar la calidad de una imagen para facilitar la observación de determinados detalles. Un sencillo ejemplo de procesado de imagen que solemos ver con cierta indiferencia es el de los mapas meteorológicos de temperaturas, en los que se colorean los mapas con diversos tonos cálidos (en la gama de los rojos) o fríos (en la de los azules) para facilitar la observación del espectador. Dentro del trabajo científico también se utiliza este sencillo sistema para destacar elementos de la imagen; así, es frecuente encontrar coloraciones con falso color en gamas cálidas o frías para destacar actividad cerebral o regionalización de estructuras en imágenes radiográficas; incluso se utiliza con éxito en la divulgación científica, para hacer más bonitas las imágenes obtenidas por el microscopio electrónico que, como todo el mundo sabe, se obtienen en el más absoluto blanco y negro. La razón de este maquillaje colorista se encuentra en que el ojo humano aprecia mucho mejor los contrastes cromáticos que las diferencias de tonos grises, tal y como lo atestigua la anatomía de la retina dotada de conos y bastones.

El procesado de imágenes puede ser útil, imprescindible en ocasiones, como un paso previo al análisis de la imagen. De hecho, mediante esta técnica se pueden destacar aquellos detalles de la imagen que se quieren medir, o eliminar aquellos otros que dificulten o enmascaren los elementos más esenciales. Es obvio que cualquier modificación de la imagen puede suponer la alteración de la información allí contenida y, por ello, cuando el procesado es un paso previo al análisis, debemos valorar si las modificaciones que se puedan producir en la imagen afectan a los parámetros de nuestro interés.

Un ejemplo biológico que puede resumir lo expuesto hasta el momento es el análisis cariotípico de un individuo cualquiera (fig. 1.1). El proceso comienza con la paralización de las células en la metafase de la mitosis, lo que normalmente se consigue con la adición de un veneno de los microtúbulos como la colchicina que impide que prosiga el reparto cromosómico. A continuación se deposita la célula sobre un portaobjetos, procurando que se rompa la membrana celular para que los cromosomas queden separados y extendidos sobre el portaobjetos. Se colorean los cromosomas y, por último, se obtiene una imagen, supongamos, fotográfica. Ahora ya tenemos posibilidad de analizar una imagen. Y ¿qué buscamos analizar? Pues el número y tamaño relativo de los cromosomas. Para ello los colocaremos ordenadamente en función de sus longitudes y de la posición relativa de su centrómero, y construiremos el idiograma.

Fig. 1.1 Cromosomas de ratón. Imagen en negativo (izq.) y positivo (der.).

El positivado en papel a partir del negativo fotográfico (que es, en realidad, la imagen captada más próxima a la original) ya es un procesado de imagen que consiste en la conversión de las partes negras de la imagen en blancas y viceversa. Este procesado tiene como único objetivo que tengamos una representación visual de los cromosomas lo más semejante posible a como los vemos a través del microscopio.

Si comenzamos nuestro análisis de imagen por el recuento de cromosomas, enseguida obtendremos el dato numérico. Es un análisis de imagen sencillo pero un análisis al fin y al cabo; incluso si algún cromosoma ha caído superpuesto a otro y sus brazos se cruzan, nuestra pericia técnica nos permite detectar que son dos elementos distintos y anotar dos marcas en vez de una. Pero si pretendemos ordenar los cromosomas por tamaño, deberemos medir sus longitudes y, conocidas sus longitudes, recortarlos y pegarlos en el orden correcto. Dejando por el momento el problema del cálculo de la longitud de un cromosoma, para separar dos de ellos que hayan caído cruzados en la muestra, deberemos hacer dos copias de la imagen para que podamos recortar en cada copia uno de los cromosomas. Una vez recortados los cromosomas se pegan en una lámina, ya ordenados y… ¡por fin!, ¡Idiograma conseguido! Pues bien, todas las manipulaciones y copias de la foto, los recortes y composición de los cromosomas, no son sino procesos sobre la imagen. El auténtico análisis, por ahora aplazado, es el cálculo de las dimensiones de los cromosomas, que es justamente lo que nos permite la correcta ordenación por tamaños.

No siempre se precisa del procesado de la imagen para realizar el análisis de imagen. El recuento de eritrocitos con una cámara cuentaglóbulos es uno de esos casos. La técnica preparatoria asegura que el recuento se pueda llevar a cabo con solo cargar la cámara de recuento; entonces el experimentador puede comprobar que unos discos refringentes, los eritrocitos, se encuentran esparcidos sobre una rejilla cuadriculada. El análisis acaba cuando obtenemos el número de eritrocitos contenidos en un número de cuadrículas determinado, esto es, en un área de referencia.

1.2 Tipos de imagen con interés biológico

Las imágenes biológicas se generan por interacción de las ondas electro-magnéticas con los objetos biológicos. En realidad todas las imágenes cotidianas del mundo que nos rodea se generan de forma semejante, aunque nuestra apreciación de lo cotidiano a veces no nos permite percatarnos de manera consciente del mecanismo por el que un objeto se hace visible a nuestros ojos. Pero como el presente manual va dirigido especialmente a los estudiantes del área de biología, nos vamos a centrar en las imágenes que con mayor frecuencia se manejan en esta disciplina.

1.2.1 Ondas electromagnéticas transmitidas

Se trata del sistema que utiliza la microscopía de transmisión. Una fuente de ondas electromagnéticas, que suele ser una bombilla en el caso de la microscopía óptica y un filamento incandescente en la microscopía electrónica (aunque en este caso la luz es un haz de electrones), genera un rayo que atraviesa la muestra biológica que se encuentra interpuesta en su camino. En la interacción de la luz con el espécimen se produce la absorción, reflexión y refracción de la luz al atravesar las distintas estructuras que componen el material biológico, con lo que la luz se desvía de su recorrido y se produce una imagen con regiones de luces y sombras.

El fenómeno de interferencia se puede incrementar con la adición de colorantes o contrastantes, según sea el caso, con distinta afinidad por los elementos de la muestra; entonces se produce la absorción de determinadas bandas del espectro de luz y de esa manera se pueden observar, en microscopía óptica, partes con diversas coloraciones que hacen más evidentes y más contrastadas las diferentes porciones de la muestra. La aplicación de contrastantes en micros-copía electrónica de transmisión hace que algunos elementos de la muestra se mantengan permeables a los electrones, mientras que otros se hagan opacos a los mismos, con lo que se produce igualmente el incremento de contraste entre los orgánulos celulares. La imagen que se genera está compuesta por zonas más o menos claras, según la concentración de los colorantes o la presencia de sustancias opacas a los electrones. Nótese que las imágenes de microscopía óptica están dotadas de color, mientras que las procedentes de microscopía electrónica son imágenes monoespectrales.

En todos los casos la característica común es que la dirección del haz de luz y la posición de la muestra forman un ángulo de 90 grados. Los fenómenos de reflexión no intervienen de manera importante en la formación de este tipo de imágenes, con excepción de ciertos casos, por lo que la imagen rara vez nos produce sensación de profundidad: se trata de imágenes, literalmente, planas.

Fig. 1.2 Epitelio de la cara inferior de la lengua del ratón. Micros-copía óptica de luz transmitida.

Fig. 1.3 Células hematopoyéticas de la dorada (Sparus aurata). Microscopía electrónica de transmisión. (Imagen cedida por el Dr. J. Meseguer. Departamento de Biología Celular. Universidad de Murcia).

1.2.2. Ondas electromagnéticas reflejadas

Este es el mecanismo que todos conocemos en la generación común de las imágenes que percibimos en la vida cotidiana. La luz procedente de una o diversas fuentes incide sobre los objetos y se refleja en ellos con un ángulo que depende del propio ángulo de incidencia del haz de radiación y de la geometría de la superficie del objeto. Además de las propias características de los objetos que hacen que se absorba una determinada cantidad de luz de un espectro determinado, la disposición relativa de la fuente de luz y la muestra hace que se obtengan sombras que le dan a la imagen sensación de profundidad.

Aparatos como los microscopios estereoscópicos, las lupas, nos proporcionan imágenes de este tipo. El microscopio de barrido genera imágenes parecidas a las descritas, aunque en realidad la imagen se produce por otro mecanismo más parecido al que trataremos a continuación, la emisión de ondas electromagnéticas. A pesar de todo, la imagen producida por este tipo de microscopio electrónico nos produce la sensación de que se trata de imágenes obtenidas por luz reflejada, porque la posición de las sombras simula esos dibujos artísticos al carboncillo en los que la profundidad la obtenemos por los bordes difusos del sombreado.

Fig. 1.4 Imagen de un embrión de pollo obtenida con un microscopio estereoscópico.

Fig. 1.5 Alga del fitoplancton (Emiliania huxleyi). Microscopía electrónica de barrido. (Imagen cedida por el Dr. J. Alcober. Departamento de Botánica. Universitat de València).

1.2.3 Ondas electromagnéticas emitidas

El tercer tipo de imagen es aquel que se produce cuando el propio objeto es el que emite la luz (o los electrones). Son muy raros los casos en los que un objeto emite luz por si mismo, sin estimulación previa del experimentador, pero incluyen un fenómeno de interés biológico como es la bioluminiscencia. Con una cámara suficientemente sensible se puede obtener una imagen de una luciérnaga, por ejemplo, o de la traza que deja durante su vuelo.

Pero el mecanismo más común que produce imágenes biológicas de este tipo es el fenómeno conocido como fluorescencia. Determinadas sustancias son capaces de absorber fotones muy energéticos al ser iluminadas con una luz de una longitud de onda específica (luz incidente) y liberar parte de esa energía absorbida como fotones de menor energía. La forma más frecuentemente utilizada es la aplicación de fuentes de luz azul, violeta o ultravioleta, que producen la emisión de luz roja, amarilla, verde o azul por las muestras biológicas.

Podemos encontrar muy diversos instrumentos biológicos que utilizan el principio de la fluorescencia para analizar las muestras; destacamos el propio microscopio de epifluorescencia, con el que se observan muestras microscópicas tratadas previamente con colorantes fluorescentes específicos o con trazadores marcados con estos colorantes. Los lectores de electroforesis para ácidos nucleicos utilizan como principio la afinidad específica de los nucleótidos por sustancias fluorescentes, como el bromuro de etidio, para iluminarlas posteriormente con luz ultravioleta y determinar las acumulaciones de estas moléculas en bandas según su peso molecular y la carga eléctrica.

Fig. 1.6 Bandas electroforéticas de ADN en un gel de agarosa. Fluorescencia de bromuro de etidio.

La microscopía electrónica de barrido se fundamenta en un fenómeno semejante. En este caso las muestras se iluminan con un haz de electrones muy energéticos que barre su superficie; esto produce la emisión de electrones menos energéticos (los llamados electrones secundarios) que son detectados por una sonda y utilizados para generar una imagen de vídeo que se ofrece en una pantalla convencional. Como se ve, el mecanismo implica la emisión de radiación, a pesar de que la interpretación de la imagen la hagamos como procedente de una lupa por su juego de luces y sombras.

1.3 La imagen real y nuestra percepción del mundo

El mundo real es tridimensional. Nuestra percepción del mundo nos da la falsa sensación de que las imágenes también lo son, a pesar de que las imágenes son intrínsecamente bidimensionales. De hecho se trata de haces de luz proyectados sobre un plano. ¿No se trata de una paradoja? La respuesta es no.

La apariencia tridimensional de las imágenes que nosotros percibimos se debe a un procesamiento de la información visual llevada a cabo por nuestro cerebro, por medio de cuatro mecanismos básicos: las referencias espaciales, el movimiento, el mecanismo de estereopar y el juego de luces y sombras.

1.3.1 Mecanismo de estereopar

La retina de cada uno de los ojos, que es una estructura bidimensional, detecta una imagen diferente del campo visual. El cerebro tiene la capacidad de sumar estas dos imágenes bidimensionales y obtener, a partir de sus diferencias, una tercera dimensión sin necesidad de ninguna otra referencia.

1.3.2 Referencias espaciales

Utilizamos las líneas de fuga que determinan la perspectiva de la imagen para estimar la distancia relativa de los objetos al observador. Siempre que miramos al horizonte vemos cómo las líneas paralelas de los objetos de nuestro campo visual se hacen confluentes en algún lugar del horizonte. Además, el tamaño relativo de los objetos conocidos nos permiten interpretar a qué distancia, también relativa, se encuentran situados. Todos tenemos una idea de la estatura normal de una persona; por esa razón, podemos interpretar que dos figuras humanas se encuentran a distintas distancias cuando una de ellas es notablemente menor que la otra y no se trata de niños o individuos sentados. Incluso interpretamos como más próximos aquellos objetos que se ven enteros y más lejanos, los que se encuentran medio ocultos por otros enteros que se sitúan delante.

1.3.3 Movimiento

En una imagen dinámica, el movimiento relativo percibido por el observador también da idea de distancia, ya que el movimiento de los objetos se percibe con una velocidad inversamente proporcional a la distancia a la que están situados: más rápidos los próximos y más lentos los lejanos. Una persona que se desplaza en un vehículo puede apreciar cómo las montañas del horizonte permanecen relativamente estáticas, mientras que las casas y los árboles desaparecen de su vista tanto más rápido cuanto más cerca se encuentran de la carretera.

1.3.4 Juego de luces y sombras

La luz emitida por una fuente luminosa puntual produce, al incidir sobre los objetos, una imagen con zonas en sombras y zonas bien iluminadas distribuidas según el relieve de los mismos. El cerebro aprovecha esta característica para extraer información sobre la dimensión y la profundidad de la imagen. Es notable que muchos sistemas de observación biológica utilizan mecanismos especiales para la creación de sombras con las que dar la sensación de relieve a las muestras, la microscopía electrónica de barrido, la microscopía de contraste interferencial o la criofractura, por ejemplo.

No obstante, no siempre percibimos en biología la tercera dimensión de las imágenes, ya que los aparatos de observación biológica más corrientes, los microscopios de transmisión (ópticos o electrónicos), producen imágenes planas. La tercera dimensión debida al grosor de las muestras queda anulada al obtenerse imágenes como proyecciones sobre el plano focal. En estos casos nuestro sistema visual no es capaz de interpretar la imagen sino como plana.

Así pues, y como conclusión, las imágenes son siempre bidimensionales, aunque el cerebro puede utilizar mecanismos que le informan de la tercera dimensión del mundo real y que le permite interpretar la imagen como tridimensional.

Esta propiedad, lejos de ser inconveniente, nos facilita en gran medida el objetivo del análisis de imagen ya que, anulada una de las dimensiones, siempre trabajaremos en el plano bidimensional. Cuando se precise el volumen como tercera dimensión, se deberá hacer intervenir el espesor del corte en aquellas imá-genes que sean proyecciones planas consecutivas, como los cortes histológicos.

1.4 Información contenida en la imagen

Pero ¿qué información se puede extraer de una imagen? Fundamentalmente hay dos tipos de información contenida en la imagen susceptible de ser extraída mediante técnicas de análisis de imagen cuantitativo: información espacial e información espectral.

1.4.1 Información espacial

Cuando nos referimos a información espacial debemos pensar en todos aquellos parámetros que se presentan en un espacio bi o tridimensional. Podemos pensar inmediatamente en las medidas de los objetos como parte de sus características dimensionales, bien sea el área, el perímetro, el volumen o sus longitudes.

Pero también podemos referirnos con el término «información espacial» al patrón de distribución de los objetos en el plano, a la posición de estos objetos en un sistema de referencia como las coordenadas cartesianas. En este caso podemos considerar como parámetros de interés la distancia entre objetos y, de aquí, otros como la agrupación o dispersión de los objetos en la imagen.

Fig. 1.7 Neuronas amacrinas dopaminérgicas de una retina de lagarto extendida sobre la superficie de un portaobjetos. Las células parecen mostrar un patrón de distribución en el plano de la retina, mostrando una distancia media entre ellas casi constante. (Imagen cedida por los Drs. F. Martínez y E. Lanuza. Departamento de Biología Funcional y Antropología Física. Universitat de València).

La información espacial proporciona datos morfométricos, datos que son la expresión numérica de la forma, tamaño, número y distribución de los objetos en la imagen.

1.4.2 Información espectral: energía radiante

Como ya se ha insistido con anterioridad, las imágenes se obtienen al interaccionar la energía electromagnética con los objetos. Salvo en el caso de que la iluminación se realice utilizando una fuente monocromática, las imágenes son multiespectrales, es decir, reflejan una mezcla de luz de diferentes longitudes de onda, de diferentes colores. Esta diversidad puede ser utilizada para obtener información cuantitativa relevante para la investigación biológica y, de hecho, muchos sistemas de análisis de imagen pueden abordar este aspecto procesando separadamente los tres colores básicos, rojo azul y verde, en los que se pueden descomponer el espectro visible. Trabajar con lo que se llama color real supone incrementar los requerimientos de los sistemas de análisis de imagen, lo que encarece el equipamiento y complica el procesado global.

En muchos casos no se necesita trabajar con una imagen de color real. Aunque volveremos sobre este asunto más adelante, queremos indicar aquí que el ojo humano detecta un objeto cuando se destaca del fondo que lo rodea; esta diferencia entre objeto y fondo se encuentra en la homogeneidad o heterogeneidad de la luz en las diferentes partes de la imagen: un área en la que aparezcan regiones con gran contraste de luces y sombras es interpretada como compuesta de objetos y fondo, mientras que un área con un nivel de iluminación homogéneo se interpreta como fondo.

Las diferencias de color también se pueden utilizar para diferenciar objetos y fondo; en este caso la homo-geneidad del color del fondo contrasta con el color de los objetos, con gamas o tonos de color distintos (fig. 1.8). Pero estas diferencias de color pueden resolverse fácilmente como diferencias de intensidad de luz utilizando filtros monocromadores. Por este motivo es corriente trabajar con imágenes monocromáticas obtenidas a partir de imágenes multiespectrales. La pérdida de información espacial es mínima y queda compensada por la simplificación del trabajo posterior y el abaratamiento de los costes.

Podemos representar la información contenida en la imagen en una gráfica tridimensional (fig. 1.9) en la que dos de las dimensiones corresponden a la situación espacial de la imagen y la tercera dimensión corresponde a la energía (como intensidad de luz) de cada punto de la imagen; la imagen se resuelve así en una función tridimensional que podría representarse como una superficie curva.

Las características espectrales de los objetos también pueden ser cuantificadas por medio del análisis de imagen. Algunos programas que permiten trabajar con imágenes con color real, permiten determinar el matiz, la intensidad y la saturación de color de los objetos de la imagen. Pero la aplicación más extendida del análisis de imagen, en lo que se refiere a la cuantificación de la luminosidad de los objetos, es la obtención de los llamados parámetros densitométricos; con ellos se puede cuantificar la cantidad relativa de luz que atraviesa o refleja el objeto, tomando como referencia una región de la imagen con intensidad de luz conocida, o refiriendo la cantidad de luz del objeto a un patrón previamente establecido. En un capítulo posterior abordaremos la utilidad de estos parámetros y la forma de obtenerlos.

Fig. 1.8 Hoja de Arabidopsis thaliana sometida a tratamiento con ozono (100 ppm). La lesión en la hoja se puede apreciar como una mancha más clara en la parte superior-izquierda. (Imagen cedida por el Dr. P. Carrasco. Departamento de Bioquímica. Universitat de València).

Fig. 1.9 Representación de un densitograma tridimensional correspondiente a la banda marcada con el cuadrado.

1.5 Objetos, fondos y campos

Nuestra experiencia de observadores biológicos nos permite reconocer inmediatamente qué parte de la imagen es relevante para nosotros. De manera intuitiva llamamos objetos a los elementos de la imagen, distinguibles e independientes entre sí, que destacan sobre el fondo que los engloba.

En realidad somos capaces de reconocer un conjunto de estructuras y elementos que tienen una naturaleza común (color, forma, textura). Para facilitar la terminología, se suele utilizar el término «fase» para nombrar aquellas partes de la imagen que tiene una misma característica. Así, en biología se utiliza el término fase para referirse, en las células por ejemplo, al conjunto de elementos de igual naturaleza: se habla de la fase mitocondrial al referirnos al conjunto de mitocondrias de una célula. En términos generales, podemos decir que una imagen compuesta por un fondo en el que destacan unos objetos presenta dos fases; y que una imagen microscópica de una roca como la que se muestra en la figura siguiente tiene cuatro fases (una por tipo de mineral).

Fig. 1.10 Muestra de gabro adelgazada hasta formar una lámina fina. (Imagen cedida por el Dr. F. Robles. Departamento de Geología. Universitat de València).

Podemos concluir que una imagen biológica está compuesta de, al menos, dos fases, en donde una corresponde al fondo y la otra a los objetos. De lo contrario, una imagen con una sola fase no puede contener más que un fondo o tratarse de una región de un objeto.

Parece evidente, por lo tanto, que percibimos la información contenida en la imagen por el contraste visual entre sus fases. Esto es, las estructuras llaman nuestra atención porque presenta diferencias de color, de intensidad o de tono respecto al fondo. Tomemos como ejemplo esta misma página del libro para ilustrar lo que estamos diciendo: los objetos, en este caso las letras, destacan sobre el fondo blanco del papel. Se trata de un convenio basado en la relevancia implícita de las cosas. ¿Por qué consideramos las letras oscuras como los objetos? Porque, evidentemente, aquí son los elementos que contienen la información. De todas maneras no es concebible un objeto sin un fondo, de forma que ambos alternan en la imagen y son complementarios.

Pero debemos reconocer que las imágenes no siempre son tan sencillas como las compuestas por fondo y objeto. Algunas imágenes pueden mostrar cierta dificultad a la hora de definir qué es fondo y qué objeto. Una imagen microscópica tomada a gran aumento, por ejemplo, o la muestra de la roca que antes mencionábamos (fig. 1.10) constituyen dos casos en los que todos y cada uno de los elementos de la imagen pueden ser relevantes para el investigador. Pero en estos casos se puede aplicar también el principio de que los distintos elementos son distinguibles entre sí por las diferencias de color, intensidad o tono de cada uno de ellos.

Es evidente que el tratamiento de las imágenes para la obtención de datos no será el mismo según se trate de la página con texto o de la roca. Mientras que en una imagen compuesta por dos fases la información esencial puede ser el número total de objetos o el tamaño de cada uno de ellos, en la otra la información relevante puede ser el espacio relativo que ocupa cada uno de los componentes.

1.6 Los objetos en análisis de imagen

A pesar de que parece obvia la definición de objeto, desde un punto de vista académico la cosa no es tan sencilla. Muchos autores rechazan la utilización del término «objeto» tal y como hasta ahora hemos venido hablando de él, porque lo consideran inadecuado.

El rechazo se debe a dos razones: por un lado, cada objeto es identificado como tal, en análisis de imagen computerizado, cuando se somete la imagen a una operación denominada segmentación, detección o delimitación. Por medio de esta operación se elimina el fondo y se mantienen los objetos; entonces se presenta la imagen de una nueva forma, como una imagen binaria, porque todo el conjunto de matices de luz y color se ha restringido a zonas blancas sobre un fondo negro, o viceversa (exactamente como las letras en el papel). Esto significa que entenderemos como objetos a un conjunto de puntos iluminados (u oscuros) agrupados, conectados, aislados unos de otros por otros puntos negros (o blancos). Todo el proceso reduce la información a islas de elementos en un mar de fondo y, por lo tanto, a una imagen plana.

Por otra parte, estas islas de información blancas o negras que resultan del proceso de segmentación pueden no ser, en verdad, objetos reales independientes, sino partes todos del mismo objeto real. Algo así ocurre cuando se obtienen rebanadas de elementos tridimensionales, las secciones histológicas por ejemplo, en las que la forma tortuosa de los objetos reales contenidos en el volumen de tejido pueden presentarse en los cortes como elementos separados unos de otros. Una sección transversal de una mano a la altura de los dedos puede ilustrar esta situación: cada uno de los dedos se presentaría como independiente en un deter-minado plano de corte, siendo que todos se unen más tarde o más pronto en un miembro único.

Fig. 1.11 Imagen ideal resultante de realizar un corte de una mano humana a la altura de los dedos.

Así pues, muchos autores prefieren utilizar el término inglés features (características) para denominar lo que nosotros hemos llamado «objetos» (las rebanadas de los dedos), y reservan la palabra «objeto» para cuando se hable de una estructura tridimensional (la mano completa). En algunos casos ambos conceptos pueden coincidir, como ocurre en las imágenes de geles sometidos a electroforesis o las imágenes procedentes de lupas o macrofotografía. Por el contrario, pocas veces una sección histológica manifestará objetos reales sino features.

Para nuestro propio gobierno, y sin ánimo de contravenir ninguna norma internacional de análisis de imagen, proponemos denominar objeto a cualquier elemento de interés que sea destacable del fondo de la imagen y que deba ser sometido a análisis. Solamente tendremos presente, en cualquier caso, cuál es el origen de la imagen. No nos referiremos al objeto real, sino a ese grupo de puntos conectados, con contigüidad topológica, que tienen características semejantes.

La forma de caracterizar un objeto contenido en una imagen es, desde el punto de vista del análisis de imagen, por medio de sus propiedades numéricas, es decir, por medio de los parámetros que definen al objeto. Cuando se trate de superficies planas, de proyecciones o secciones de muy poco espesor, podremos recurrir directamente a la morfometría para caracterizar numéricamente los objetos. Cuando queramos obtener información tridimensional de los objetos reales a partir de las secciones o las proyecciones planas, recurriremos a la estereología.

1.7 Morfometría y estereología

Denominamos morfometría al conjunto de técnicas que nos permiten obtener las características dimensionales de los objetos. Utilizamos estas técnicas para determinar los valores de los parámetros que definen los objetos, como son el área, el perímetro, la longitud o la anchura.

Ya dijimos que el procedimiento general de medida comienza en las secciones histológicas, los esquemas o las proyecciones de las imágenes, por lo que nos encontramos en un mundo de dos dimensiones. La tercera dimensión y las relaciones dimensionales en el volumen de una muestra requieren un tratamiento especial, impuesto, principalmente, por la naturaleza propia de las muestras biológicas. Explicaremos con un sencillo ejemplo esta particularidad.

Supongamos que queremos estimar el diámetro nuclear de los hepatocitos. Como es corriente, hemos preparado cortes histológicos de hígados previamente fijados e incluidos en parafina o resinas sintéticas. Con el fin de que se puedan observar los detalles de las células, procuramos que los cortes sean suficientemente delgados, de unas pocas micras de grosor. Una vez contrastados los núcleos con los colorantes habituales, tomamos las imágenes para medirlas. Como los núcleos de los hepatocitos son prácticamente esféricos, un corte en cualquier sentido siempre nos proporciona una sección circular; pero es casi seguro que encontraremos núcleos de muy diversos tamaños, como cabría esperar si cortamos una esfera por un plano al azar: unas veces el plano pasaría cerca del polo y otras cerca del ecuador. Entonces, ¿cómo sabemos el diámetro real del núcleo?

Si hacemos varios cortes en serie, podemos llegar a cortar un núcleo completo desde un polo al otro. Localizando un núcleo en concreto y siguiendo su silueta en cada uno de los cortes, podremos estimar su diámetro aproximado de dos maneras:

1 Contando el número de cortes en el que aparece el citado núcleo y multiplicando ese número por el grosor teórico de cada corte (lo que supone una medida muy incierta),

2 O midiendo el diámetro del núcleo en cada sección y tomando como diámetro mayor el mayor de los diámetros obtenidos.

Ambos procedimientos son laboriosos y no se encuentran exentos de incertidumbre. Si ahora queremos aplicar el método a una población de células con dos tipos de núcleos de distintos tamaños, el problema se complica hasta un límite insospechado. La determinación del diámetro mayor del núcleo en cada corte nos resuelve el tamaño del núcleo más grande, pero el núcleo de menor tamaño no lo localizaremos con exactitud, porque su diámetro mayor se confundirá con los de los cortes no centrales del núcleo más grande. Con la ayuda de la estereología y una cierta habilidad matemática podríamos acercarnos mucho más a la estimación del diámetro real del núcleo del hepatocito.

Como se ve, la estimación del diámetro de cada sección del núcleo es una tarea morfométrica, pero para la estimación del diámetro real de un objeto tridimensional necesitamos tener en cuenta algunas otras reglas que nos proporciona la estereología. Podemos definir la estereología como un cuerpo de métodos matemáticos que relacionan parámetros tridimensionales, que definen la estructura, con medidas bidimensionales obtenidas de las secciones de las estructuras.

2. Algunos métodos manuales para la estimación de medidas

2.1 Qué medir y cómo

Hemos expuesto en el capítulo precedente las bondades del cerebro humano en el reconocimiento de las más sutiles características de las imágenes y su «incapacidad» para apreciar las dimensiones de las cosas. Y sin embargo, tanto en biología como en otras ramas de la ciencia, la magnitud de las cosas es la cualidad más relevante para el investigador, porque por medio de la comparación de estas magnitudes es como puede percibir y cuantificar las diferencias o las semejanzas entre los elementos que está estudiando.

Así, por ejemplo, la relación entre la dosis y su efecto suele detectarse por la variación de la magnitud de un parámetro sensible al tratamiento, como el número de elementos o el tamaño de los mismos; o por ejemplo, la influencia de unas determinadas condiciones experimentales sobre los seres vivos; o la pauta de crecimiento y diferenciación de una estructura anatómica. En todos los casos la clave se encuentra en las diferencias de magnitud entre el grupo control y los distintos grupos experimentales, o entre una y otra población experimental. Pero, ¿qué queremos decir con diferencias de magnitud? ¿De qué magnitudes estamos hablando?

Las dos magnitudes más frecuentemente buscadas en biología son el número de elementos presentes y el tamaño de los mismos. Si bien el recuento de elementos no presenta muchas dificultades, la determinación del tamaño de un elemento puede ser una tarea ciertamente complicada. Dependiendo de la forma que adopte el objeto de nuestro interés, el tamaño puede venir determinado por la longitud, como en los ofidios, el área, como en la amplitud de los territorios de caza, el volumen, como en la capacidad de almacenamiento de glucógeno del hígado, el perímetro, y un largo etcétera de otros muchos parámetros de muy diversa utilidad.

En cada caso debemos enfrentarnos a la imagen con herramientas distintas para estimar cada una de las magnitudes que apuntábamos. Podemos obtener una longitud con cierta exactitud utilizando una regla, pero el cálculo del área es una tarea un poco más compleja. Y no digamos si queremos obtener un volumen de algo tan pequeño como una célula; la tarea se nos puede antojar casi imposible.

Los primeros métodos de medida que vamos a describir podíamos denominarlos métodos manuales, porque para abordarlos no nos apoyaremos más que en la imagen y en algunos principios de la geometría. Con ellos pretendemos dotar de una herramienta lógica y sencilla al lector, rescatándolo momentáneamente de la tiranía informática.

Por otra parte, el estudio de estos métodos tiene el interés adicional de que constituyen el nexo natural con la estereología y que su estudio nos permitirá reflexionar sobre problemas geométricos y espaciales que, en ocasiones, parecen estar abandonados en las técnicas ordinarias de análisis de imagen asistido por computadora. Decimos que este conjunto de métodos de medida se encuentra muy próximo a la estereología porque se implementaron lejos de la tecnología digital del análisis de imagen, con una gran base geométrica, un claro objetivo cuantitativo y, justamente, para poder inferir información tridimensional a partir de cortes histológicos. Por estos motivos algunos colegas los consideran los auténticos métodos biológicos de medida. Nosotros no queremos ser tan taxativos porque somos conscientes de que los métodos computerizados aportan tantas y tan buenas soluciones, que sería un tanto irreflexivo negar sus ventajas. De todas maneras, los métodos que estudiaremos a continuación pueden sacarnos de algún que otro apuro cuando, por ejemplo, nuestro ordenador se niegue a seguir nuestras instrucciones.

2.2 Estimación del área

2.2.1 Aproximaciones geométricas

El cálculo del área de un objeto puede ser algo muy sencillo cuando el objeto se aproxima a una figura geométrica regular. La geometría nos facilita el cálculo de superficies de objetos regulares, circulares o rectangulares por ejemplo, a partir de su radio o de la longitud de sus lados. Pero este no suele ser el caso más frecuente y la aproximación a una figura de geometría regular no está exenta de cierta imprecisión, dependiendo de la forma del objeto y la capacidad de apreciación del observador.

Con un sencillo ejemplo podemos ilustrar cuándo sería aplicable el método basado en la aproximación a una figura geométrica regular. Supongamos que queremos averiguar el volumen de sangre que circula por un segmento de la arteria aorta de un centímetro de longitud; para ello disponemos de dos cortes transver-sales de sendas aortas fijadas en contracción y relajación (en sístole y diástole cardiaca), porque la presión sanguínea hace que se deforme la pared elástica de la arteria y es evidente que los momentos cumbres de máximo y mínimo contenido corresponderán a los volúmenes arteriales en ambas circunstancias¹. La imagen real se parece mucho al esquema presentado en la fig. 2.1.

Fig. 2.1 Idealización de la sección transversal de una arteria en estado de máxima dilatación (izquierda) y en relajación (derecha).

Nótese que la sección de la arteria se puede aproximar, en ambos casos, a un círculo, aunque más perfecto en la etapa de sístole que en la de diástole; la irregularidad apreciable en la diástole se debe a que, en este periodo, se produce un contorno festoneado en la arteria como consecuencia de la relajación de las fibras elásticas que forman la pared. Aun así podemos considerar que la luz de la arteria en ambos momentos se puede aproximar a un círculo, por lo que podremos estimar directamente en el microscopio, mediante un micrómetro ocular, o sobre imágenes fotográficas de las preparaciones, utilizando una sencilla regla, el diámetro interior de las aortas y aplicar la fórmula del área del círculo (A=πr²). Pero esta forma de medir el diámetro esta sujeta a una buena dosis de subjetividad, ya que es el observador quien decide cuál es el diámetro de la aorta, que puede ser o no el diámetro real.

Para evitar en cierta medida esta subjetividad, se ha venido utilizado otro método que consiste en inscribir el objeto en un círculo de área conocida, mediante la superposición de una plantilla de círculos concéntricos al objeto. Es algo semejante a como se mide el diámetro del dedo en algunas joyerías que utilizan un conjunto de anillos de diferentes tamaños. La medida así obtenida se ha denominado, tradicionalmente, área del círculo equivalente y también se encuentra repleta de una buena dosis de subjetividad. El área del círculo equivalente ha tenido un uso muy generalizado en el pasado y dio lugar a pequeños instrumentos que facilitaban su estimación. Un fabricante de microscopios diseñó un pequeño diafragma para el ocular que permitía cerrar un anillo alrededor del objeto situado en el campo de observación; un lector en forma de regla, dispuesto en el exterior del ocular, proporcionaba al investigador la longitud del diámetro del diafragma en un momento dado y le permitía estimar el área del círculo equivalente.

También podríamos inscribir el objeto en un paralelepípedo en lugar de en un círculo. De esa manera mediríamos dos diámetros, los dos lados del rectángulo, con lo que podríamos utilizar el valor promedio para calcular el área del círculo promedio. Esta otra forma de proceder no supone ningún incremento de fiabilidad, pero sí que nos facilitaría la obtención de la medida de los diámetros porque es mucho más sencillo trazar un rectángulo que inscriba al objeto que ajustar una circunferencia a lo largo de todo su perímetro.

2.2.2 Recuento de áreas unitarias

Podríamos limitar un poco más la subjetividad del observador complicando el sistema de medida mediante el trazado de un cuadrado que inscriba al objeto. En ese caso podríamos inscribir el objeto en esta figura geométrica, pero dividiendo, a su vez, el cuadrado en tantos otros pequeños cuadrados como fuésemos capaces de dibujar; Ahora deberíamos contar cuántos cuadraditos pequeños enteros caben dentro del perímetro del objeto; como sabremos el área de uno de ellos, la suma de todas las áreas será, aproximadamente, el área del objeto. Es obvio que este tipo de «papel milimetrado» nos permitiría aproximarnos al área total del objeto de manera más objetiva, teniendo como límite de apreciación el tamaño del cuadradillo más pequeño. Es un método más fiable pero muy laborioso. Ya veremos más adelante como la automatización ha solventado el problema del trabajo manual.

2.2.3 Método de la pesada

Pero en muchas ocasiones necesitamos la medida del área como parámetro comparativo entre dos lotes experimentales. En este caso la comparación de las áreas puede realizarse por medio de otros estimadores más sencillos y menos laboriosos. Pondremos como ejemplo un caso que contribuyó decisivamente al desarrollo de las técnicas automatizadas de medida.

En los inicios de la era industrial, las factorías del acero necesitaban disponer de una norma con la que clasificar la calidad de los aceros que estaban produciendo. Tal calidad dependía de la cantidad relativa de hierro y carbón en la aleación, con lo que los laboratorios de control de calidad se propusieron desarrollar un método con el que estimar la proporción de ambos componentes de la aleación, analizando el área relativa de ambos en una imagen microscópica. Un conjunto de técnicos preparaba las láminas de acero que eran fotografiadas al microscopio; las imágenes presentaban dos tipos de manchas de distinta tonalidad que correspondían al hierro y al carbón. A continuación se recortaban las manchas en las fotografías para hacer dos montones de retales, uno para cada tipo de componente. Como el grosor del papel fotográfico era el mismo en toda la foto y la cantidad de plata que daba el tono más o menos oscuro a cada mancha de los componentes era tan reducida como despreciable, la abundancia de cada componente era proporcional al peso de los retales de cada especie. Esta medida relativa se expresaba como una fracción, peso de uno partido por peso del otro, o como el valor porcentual de un peso y del otro respecto al peso total.

El fundamento teórico del método de la pesada lo podemos encontrar fácilmente si aplicamos el concepto de densidad.

La densidad de una sustancia se define como la relación entre una determinada masa y el volumen que esta ocupa. La relación se mantiene constante sea cual sea la cantidad de sustancia considerada, por lo que si tomamos dos fragmentos cualesquiera del papel fotográfico (con masas m₁ y m2 respectivamente), y suponiendo que la escasa cantidad de emulsión fotográfica no modifica sustancialmente la densidad, podremos expresar esa relación, para cada fragmento, de la siguiente manera:

si calculamos los respectivos volúmenes (v₁ y v₂) en función de la respectivas superficies tendremos que

Sí eliminamos el término «grosor», la expresión queda justo como habíamos expuesto más arriba:

El método es tan ingenioso como laborioso porque, para darle validez estadística a los datos, se debía preparar un buen número de fotografías que habían de ser recortadas y pesadas. En estas circunstancias el trabajo final llegaba a ser importante, sin contar con el tedio que suponía la rutina general. Pero no podemos hacer otra crítica y tenemos que reconocer que se trata de un estimador del área muy aceptable.

2.2.4 Estimación del área por el método de la rejilla de puntos

La idea que subyace en el método de la pesada es que la fase más abundante en una foto ocupará mayor cantidad de área, por lo que la suma de los pesos de los trozos de papel que constituyen dicha fase será mayor que los pesos del resto de las fases. Lo mismo lo podemos enunciar en términos matemáticos diciendo que: «la probabilidad de que encontremos un trozo de hierro o carbón dependerá de su abundancia». O sea, que si dejamos caer al azar una minúscula gota de tinta sobre la fotografía de un acero, la probabilidad de que caiga sobre uno u otro componente dependerá únicamente de la abundancia de dicho componente. Pues bien, siguiendo ese principio, la determinación del área que ocupa una fase se puede ver desde un punto de vista probabilístico.

Si superponemos sobre la imagen una rejilla formada por puntos distribuidos regularmente, la cantidad de área que ocupa una determinada fase será proporcional al número de puntos (n) que caen sobre dicha fase. Si conocemos el total de puntos de la rejilla (N) y el área en la que se encuentran distribuidos (Área de referencia), el área de la fase se puede obtener por medio de una simple regla de tres. Es decir:

Fig. 2.2 Rejilla de puntos sobre una imagen.

El cociente n/N se conoce como fracción de área y es justamente la relación entre los puntos que caen sobre la fase de interés y los puntos totales que contiene el área de referencia. De ahora en adelante nos referiremos a la fracción de área, de forma abreviada, como A_A y su significado será el de: la proporción de área ocupada por la fase, o por un elemento, respecto al área de referencia; su valor se suele expresar en tantos por ciento.

El método es igualmente válido si se aplica una plantilla en la que el mismo número de puntos se encuentra repartido sin orden, en una distribución al azar. Se trata de una forma manual y simplificada del primitivo procedimiento denominado flaying spot (véase capítulo 3), en la que se ha predeterminado la situación de los puntos sobre la plantilla. Su aplicación se basa estrictamente en la aplicación del principio de probabilidad geométrica (véase capítulo 13).

La limitación principal para la utilización de plantillas con distribución regular o irregular de puntos está en que los objetos que pertenecen a la fase de interés se encuentren ordenados o no en la imagen. Esta afirmación casi resulta obvia si tenemos en cuenta que en una distribución regular de elementos pertenecientes a una misma fase, la ordenación de los puntos de la rejilla puede no coincidir nunca con los elementos de la fase o, por el contrario, que el número de coincidencias de puntos y estructuras de la fase sea excesivamente elevada. En ese caso se rompe la situación viciada utilizando una plantilla cuyos puntos se encuentren distribuidos aleatoriamente.

2.3 Estimación de la longitud

Uno de los parámetros que revistió más dificultad de cálculo, hasta que comenzó la aplicación del ordenador digital al análisis de imagen, fue la deter-minación de la longitud de un objeto. Se puede pensar que los objetos rectilíneos se miden fácilmente con una regla y que se puede calcular su longitud a escala real, multiplicando la medida obtenida por un factor de corrección. Pero, lamentablemente, las más de las veces los objetos suelen ser irregulares, con curvaturas, salientes y entrantes. En objetos muy estrechos solemos hablar de longitud, pero en la mayor parte de los casos hablamos de longitud y anchura. Incluso podemos hablar de determinar el perímetro, el cual se puede determinar como la longitud del borde que limita el objeto.

Para los objetos rectilíneos y estrechos, se pueden obtener buenos resultados utilizando una regla. También disponemos de un pequeño instrumento, el planí-metro, que nos permite obtener longitudes curvas y, por lo tanto, perímetros. Pero este instrumento ha ido cayendo en desuso y cada vez es más difícil encontrarlo en los laboratorios. Aunque los modernos sistemas de análisis de imagen han resuelto con sencillez el problema de la obtención de los principales diámetros de un objeto, la morfometría cuenta hace tiempo con un método que, como veremos, permite determinar longitudes de manera simple y efectiva.

2.3.1 El método de Buffon

Sea como fuere, el cálculo de la longitud de un objeto no parece, a primera vista, una cosa sencilla. Y no lo sería si no fuera porque Buffon² se hizo esa misma pregunta hace años y llego a proponer una solución tan simple como la que describimos más abajo.

Buffon planteó el problema de la medida de la longitud de unas agujas de igual tamaño. Postuló que, si se dejan caer las agujas al azar sobre una hoja en la que ha dibujado un conjunto de líneas paralelas equidistantes una distancia d, la probabilidad (p) de que una aguja de longitud L toque una línea paralela es:

Fig. 2.3 Las agujas de Buffon.

Esto quiere decir que la probabilidad depende, de manera directa, del tamaño de las agujas y, de manera inversa, de la distancia entre las líneas paralelas. Ambas cosas resultan obvias porque es más fácil que se produzcan coincidencias cuando las líneas paralelas están separadas una distancia menor que la longitud de las agujas, que cuando las agujas sean muy pequeñas y la distancia entre las paralelas sea muy grande. Esto mismo lo hemos querido representar gráficamente en la fig. 2.4.

Se puede llegar a la fórmula (2.6) de una manera muy simple. Una aguja cualquiera, perpendicular a las líneas paralelas tiene una probabilidad (p) de intersección con cualquiera de ellas:

Fig. 2.4 Cálculo de intersecciones entre las paralelas de Buffón y dos conjuntos de líneas de longitud L y L/2 respectivamente. Es obvio que la probabilidad de intersección en el primer caso, el grupo de líneas de longitud L, será el doble que en el conjunto de longitud L/2.

Cuando la aguja no es perpendicular a las líneas de test, la probabilidad de intersección depende del ángulo (α) que formen entre sí. De hecho, la probabilidad de intersección en cualquier posición del segmento L se puede expresar en función de su proyección (y) sobre un eje perpendicular a las líneas de test (fig. 2.5):

Fig. 2.5 Proyección de una aguja sobre el eje de ordenadas.

en donde la longitud de la proyección y se puede calcular como

La probabilidad de intersección será entonces

Para considerar todas las posibles orientaciones del segmento respecto a las líneas de test, debemos integrar la función (2.9) entre cero y 90 grados (π/2 radianes), lo que nos permite expresar la ecuación como:

que es exactamente la ecuación (2.5).

Podemos utilizar a expresión (2.5) para despejar L. Así,

lo que quiere decir justo lo que acabamos de expresar más arriba, pero de forma matemática: la longitud de una aguja se puede calcular si conocemos un sistema de referencia de líneas paralelas y la probabilidad de que las líneas corten a las agujas cuando las dejamos caer al azar.

La probabilidad a la que nos estamos refiriendo una y otra vez tiene el sentido tradicional que todos conocemos; es decir, se trata de un estimador de cuántas veces se produce un evento concreto cuando se repite el ensayo un número determinado de veces. Tal vez el ejemplo paradigmático sea el de la moneda que se tira al aire: el evento favorable «sacar cara» tiene una probabilidad de que ocurra p=1/2, porque el total de eventos posibles, «cara» y «cruz», son solamente dos. La forma práctica de calcular experimentalmente esta probabilidad consiste en lanzar la moneda al aire una serie de veces (N) y anotar cuantas de estas veces sale cara (Vcaras), entonces la probabilidad es p =Vcaras/N y, si lo hemos hecho de manera correcta, el valor de esta probabilidad coincidirá con la expuesta arriba p=1/2.

Para el caso que nos ocupa, la probabilidad de que se produzcan cruces entre líneas paralelas y agujas se podría calcular tal y como lo hicimos con la moneda: si realizamos el experimento N veces y el número de intersecciones agujas-conlíneas-paralelas es n, la probabilidad, p, se puede expresar como

Si sustituimos esta expresión en la (2.11) podemos proponer una nueva ecuación:

que nos permite estimar la longitud de las agujas de manera experimental, contando el número de intersecciones entre agujas y líneas paralelas.

Si realizados la medida una sola vez, N=1, la expresión se simplifica y queda:

en donde el término (nd) es el número de intersecciones por línea (I_L= nd).

Pero la aplicación de este procedimiento puede ir más allá del simple cálculo de las longitudes. Se puede aplicar para calcular el perímetro de una figura plana.

2.3.2 Cálculo del perímetro

Fig. 2.6 Cálculo del perímetro de un elemento.

Si consideramos que el perímetro está formado por un conjunto de segmentos iguales, como hemos dicho antes, aplicando el mismo principio se puede escribir la expresión como

en donde I_L es también el número de intersecciones de la línea que forma el perímetro con las paralelas separadas una distancia d.

Podemos demostrar la validez del método con un ejemplo: supongamos que se quisiera calcular el perímetro de una circunferencia de radio r. Si trazamos una serie de líneas paralelas separadas una distancia d=r, el número de intersecciones entre las líneas paralelas y la circunferencia será n=4 (fig. 2.7). ¿Por qué n=4? Porque la circunferencia sólo puede caer de dos maneras entre las paralelas:

Fig. 2.7 Cálculo de la longitud de una circunferencia.

1 Si hacemos que una de las líneas paralelas sea tangente a la circunferencia, la siguiente línea cortará a la circunferencia por el mismo centro, y la siguiente paralela también será tangente a la circunferencia. Por lo tanto el número de puntos que intersecta será n=4: dos en las tangentes, más dos en la línea secante que pasa por el centro (fig. 2.7 A).

2 Si hacemos que la primera línea paralela sea secante a la circunferencia, la siguiente será secante también y el número de puntos también será n=4 (fig. 2.7 B y C).

Sustituyendo en la fórmula (2.14) obtendremos la siguiente expresión:

que simplificando queda

lo que resulta la bien conocida expresión de la longitud de una circunferencia.

El método es más exacto cuando se aplica en el cálculo de perímetros curvos que cuando se utiliza para calcular el perímetro de formas angulosas. La imagen siguiente (fig. 2.8) muestra la aplicación del método al cálculo del perímetro de un cuadrado y se puede comprobar el error que se introduce en estos polígonos. Conforme se incrementa el número de lados, tanto más se aproxima la figura a la circunferencia y más exacta es la determinación.

Fig. 2.8 Cálculo del perímetro de un cuadrado de lado 2d por el método de Buffón.

El criterio correcto de aplicación del método de Buffon es el mismo que rige en la obtención de cualquier magnitud: se debe calcular el perímetro varias veces, superponiendo cada una de ellas el sistema de paralelas al objeto haciendo que la superposición sea de forma aleatoria. La expresión de la medida será el promedio de cada una de las determinaciones y el error relativo será la desviación tipo.

En el ejemplo se muestran tres cuadrados iguales de lado 2d dispuestos sobre una serie de líneas paralelas separadas una distancia igual a d. Aplicando la fórmula del perímetro del cuadrado a este caso tenemos:

Si ahora aplicamos el principio de Buffon al cálculo del perímetro de cada uno de los cuadrados tendremos:

Es evidente que ninguno de los perímetros calculados coincide con el perímetro esperado porque, para que así fuese, el número de intersecciones de los cuadrados con las paralelas debiera ser aproximadamente de 5,095 y esto es, claramente, el promedio de intersecciones que se pueden obtener después de realizar la prueba un buen número de veces.

La conclusión es, como ya sabíamos, que se trata de un método basado en la probabilidad geométrica y que su exactitud también se encuentra sometida a las leyes de la estadística.

2.4 Errores de medida

2.4.1 Unidades de medida y errores

La preocupación por la exactitud de la medidas no es un asunto exclusivo de la morfometría sino que se trata de un problema de carácter general. El hombre desarrolló, cuando tuvo necesidad de ello, un sistema de pesas y medidas con el que resumir el mundo al número. Este hecho le permitió calificar los fenómenos y las cosas con una propiedad inherente a ellos mismos: sus dimensiones. El número revolucionó el pensamiento helénico y luego, gracias a los árabes, revolucionó el mundo renacentista. Aquella revolución ha llegado hasta nuestro tiempo, con las acotaciones pertinentes producto de cientos de años de experiencia en la obtención de las medidas de las cosas.

Cada comunidad había desarrollado un patrón de medida (tomemos la longitud como ejemplo), que había subdividido o ampliado para tratar de obtener las dimensiones de las cosas pequeñas y las grandes. En todos los casos, y para desespero de los científicos de la época, el objeto medido no solía contener un número exacto de veces el patrón de referencia. Esto ocurría siempre, aunque se subdividiese la unidad de medida una y otra vez. Además, cada individuo apreciaba de manera distinta cuántas veces se contenía la unidad de medida en el objeto al realizar la medida. Incluso cuando un mismo experimentador medía varias veces el mismo objeto, obtenía distintos valores en cada medida.

La física, que es la encargada de estos temas dimensionales, introdujo el concepto de error para explicar la limitación del patrón de medida y del experimentador. Así, la primera limitación, la falta de coincidencia de la unidad de medida con el objeto un número entero de veces, se podía salvar indicando el número de veces que se contenía la unidad de medida, más el número de fracciones de la unidad que aún era mayor el objeto (eso supone la invención de los números reales), pero añadiendo una coletilla donde se indicaba cuál era la fracción más pequeña en la que se había subdividido la unidad que se estaba utilizando. Esto se interpretaba como que la fracción de la unidad de medida no daba más de sí y que el objeto media, por lo tanto, más o menos esa cantidad fraccionaria. A ese último término le llamamos error absoluto y nos permite saber cuan fiable es el instrumento de medida del que nos servimos.

Para glosar con un ejemplo lo que acabamos de decir, queremos recurrir a una situación doméstica corriente: imagínense que van a comprar doce metros de cable eléctrico a la ferretería para construir un alargador para enchufar su nuevo ordenador a la red eléctrica. Todos esperamos que el dependiente nos corte un trozo de cable equivalente a doce veces una vara o una cinta de un metro de longitud. Pero imagínense que en la ferretería tienen una vara que mide cinco metros y que no esta subdividida de ninguna manera. Está claro que medirá con toda precisión cables que contenga la unidad de medida un número entero de veces, es decir, cinco, diez, quince metros. Incluso podrá medir, aunque con menos exactitud, siete metros y medio o doce metros y medio, lo que equivale a tomar la mitad de la vara, 2,5 metros, (aquí tendremos que fiarnos del buen ojo del dependiente). Todo lo que sea menor de esa medida tomada con esa unidad será un intento de aproximación a la longitud de cable, tanto más dudoso cuanto más se aleje de la fracción 2,5 metros.

Afortunadamente, en lo cotidiano no llegamos a encontrarnos dependientes con tan mala unidad de medida, sino que las tiendas cuentan con unidades de un metro, divididas en cien fracciones (centímetros). Seguramente podremos adquirir doce metros de cable, centímetro arriba, centímetro abajo. Esto se puede expresar como 12,00 ± 0,01 metros, lo que se lee como «doce metros, más o menos un centímetro».

No obstante, el error que se comete midiendo el cable con una barra de un metro de longitud (tomando doce unidades para completar los doce metros) es mayor que el error que se comete si utilizamos una cinta de doce metros y se realiza la medida de una sola vez, porque los errores de medida son aditivos.

Si compramos dos trozos de cable en dos tiendas distintas, pidiendo en cada caso la misma longitud de cable, y los comparamos cuidadosamente, comprobaremos que uno es más largo que el otro. ¡Aunque cada dependiente se haya tomado el mismo interés en realizar la medida! El experimentador sabe que, por muy bueno que sea el instrumento, la medida del objeto no la obtiene nunca de forma exacta, sino que se aproxima a ella tanto más cuanto más veces se realice la misma.

Ambos errores son insolubles y hoy han entrado a formar parte de lo que llamamos condiciones de la medida.

Una cuestión casi obvia es la relatividad del error; esto es, la relación entre el error absoluto y la medida a obtener. Es una forma de indicar lo ajustado de la medida: siempre será más precisa la medida del cable de doce metros determinada con un error de un centímetro, que la medida de un cable de medio metro con el mismo error. Denominamos error relativo al cociente entre el error absoluto y la magnitud medida.

2.4.2 Precisión del método en función del número de puntos de la rejilla

El error relativo de una medida depende del error absoluto, digamos del error intrínseco del instrumento de medida, y de la magnitud obtenida. Su cálculo es muy simple cuando utilizamos una regla, dividida en milímetros, con la que medimos la longitud del cable alargador; el error absoluto será igual a 0,01 metros, mientras que el error relativo se obtendrá del cociente

Pero, ¿cómo obtenemos el error en el caso de la medida del área a partir del método de la rejilla de puntos? Es fácil pensar que la exactitud de este método del cálculo es más que discutible, dependiendo del tipo de rejilla que utilicemos.

En efecto, si se utiliza una rejilla con tan solo cuatro puntos, por ejemplo, y el objeto toca un único punto, el área del objeto sería igual a 1/4, independientemente del tamaño del objeto. Si, por el contrario, el objeto no toca ningún punto, el área será cero. Igualmente podemos ponernos en el otro extremo y pensar que para tomar una medida válida se necesitaría superponer una rejilla con tal cantidad de puntos que haría inviable la utilización del método.

Pero, como ya se puede suponer, siempre se puede llegar a una situación de compromiso en la que, estableciendo a priori un error tolerable, podamos superponer una rejilla con suficientes puntos como para que se pueda hacer viable el recuento.

Fig. 2.9 Representación gráfica del efecto del número de puntos de la rejilla sobre la estimación de la fracción de área.

La estadística nos dice que la estimación de la fracción de área por medio del recuento de puntos presenta una distribución de tipo binomial, en la cual el error estándar de una proporción cualquiera ρ viene dada por la expresión:

A partir de esta expresión, Hally³ propuso una fórmula con la que calcular el error relativo estándar de la medida de la fracción de volumen, y que nosotros hemos adecuado a este problema:

en la que AA es la fracción de área correspondiente n/N;

n es el número de puntos que contiene el objeto y

N es el número de puntos totales de la rejilla.

Por lo tanto, haciendo una estima previa de la fracción de área con una rejilla cualquiera, podemos estimar cuál es el número idóneo de puntos totales de la rejilla para asumir un error máximo determinado.

Despejando n

Y como

El número de puntos totales que debe tener la rejilla para obtener una fracción de área con un error relativo determinado, será:

Un ejemplo ayudará a aclarar la utilidad de este apartado. Para ello vamos a utilizar la fig. 2.9.

De los 72 puntos (N = 72) que forman la rejilla, hay un total de 16 (n = 16) que caen en el interior del objeto A, por lo que su fracción de área A_A = 16/72 = 0,22.

Aplicando la fórmula de Hally obtendremos un error relativo de

Lo que supone un error del 22,07 %, partiendo de una rejilla de 72 puntos.

Para calcular el tamaño de rejilla necesario para obtener la fracción de área con un error menor o igual al 10 % tendríamos:

Esto es, deberíamos preparar una rejilla que contuviese más de 355 puntos, lo cual supondría que unos 78 puntos habrían caído dentro del objeto A.

Bien mirado no se trata de una rejilla excesivamente densa, aunque obtener la medida con precisiones mayores puede llegar a hacer imposible la preparación de una rejilla adecuada, y no digamos cómo de compleja podría ser la tarea de recuento de puntos.

2.4.3 El error experimental

El concepto de error en las ciencias experimentales tiene otras perspectivas, relacionadas con la heterogeneidad del universo de medida. El principal estimador de cualquier parámetro experimental es el valor promedio de las medidas realizadas, el cual se encuentra directamente relacionado con la variabilidad de la muestra. Para estimar la dispersión del promedio se calcula la desviación tipo, que se puede entender como el promedio de diferencias entre los valores obtenidos y la media.

Comúnmente se denomina error tipo a la diferencia promedio, porque el investigador utiliza este valor, entre otras cosas, para comprobar el grado de reproducibilidad de sus experimentos y, por lo tanto, comprobar si se han producido errores en la manipulación o el diseño de los experimentos.

No vamos a profundizar aquí sobre el análisis estadístico de los resultados porque creemos que el lector dispone de otras fuentes, más adecuadas que esta, para procesar adecuadamente sus datos. Pero sí queremos reflexionar sobre una cuestión que incide directamente sobre la forma de preparar las muestras para análisis de imagen y sobre el trabajo, en tiempo y esfuerzo, que conlleva realizar las medidas morfométricas.

La pregunta sería: ¿Es más precisa la determinación tomando muchas muestras de un solo individuo o tomando muchos individuos y muchas muestras por individuos? Una respuesta muy primaria sería que la virtud está en el punto medio y se deben tomar las muestras necesarias y suficientes. Pero si reflexionamos sobre nuestras condiciones experimentales sacaremos algunas conclusiones que pueden sernos de mucho provecho.

Supongamos que vamos a realizar un análisis del efecto que cierto tratamiento produce en el diámetro de los túbulos renales. Supongamos también que el primer paso en nuestro experimento es establecer el diámetro normal de los túbulos de los riñones control. Para ello disponemos de un riñón por cada n₁ individuos normales que procesamos hasta obtener secciones histológicas en las que determinar las dimensiones de los túbulos en varios campos por sección. Buscando la máxima aleatoriedad en el muestreo, la preparación de las muestras sería:

a) cada riñón se fragmenta en n₂ rebanadas;

b) de cada rebanada se preparan n₃ bloques para cortar;

c) de cada sección se recuentan n₄ campos;

si denominamos S²_i a la varianza en cada paso, la varianza global del experimento S2 se calcularía como:

Parece claro que los denominadores de las fracciones son cada vez mayores, con lo que la contribución de cada fracción a la varianza global es cada vez menor. El término más significativo es precisamente el que depende del número de individuos que intervienen en la experiencia, como intuyen los experimentadores. Por ello debemos tener presente que el error disminuye más tomando mayor número de riñones que haciendo más recuentos por campo y riñón.

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1. Ni que decir tiene que las estructuras orgánicas sufren cierta retracción como consecuencia de la acción de los fijadores. En el ejemplo propuesto hemos obviado este efecto, aunque en los análisis de muestras fijadas siempre deberemos tener en cuenta este fenómeno.

2. Georges-Louis Leclerc, Conde de Buffon (1707-1788), nacido en Montbard, Francia, fue un notable naturalista que, además de contribuir de manera decisiva al establecimiento de las bases de lo que luego sería la Teoría de la Evolución de Darwin-Wallace, realizó importantes contribuciones en el área de la matemática. Unas de estas contribuciones ha quedado perpetuada con el nombre «Las agujas de Buffon».

3. Hally A. D. (1964): «A counting method for measuring the volumes of tissue components in microscopical sections», Quarterly Journal of Microscopical Sciencie 105: 503.

3. Análisis de imagen asistido por ordenador

3.1 Orígenes del análisis de imagen

A pesar de la importancia que han alcanzado los métodos cuantitativos basados en el análisis de imagen en la investigación biológica, estas técnicas no surgieron alrededor de las necesidades de la biología sino que son consecuencia de las necesidades que tenía la industria metalúrgica de disponer de métodos fiables y rápidos para el control de la calidad de los aceros.

Las plantas siderometalúrgicas producen aceros de diversas calidades que, obviamente, se venden a precios diferentes. Las variedades del acero dependen, básicamente, de la aleación del hierro con muy diversos elementos, entre los que ocupa un lugar preponderante el carbón. Tradicionalmente se determinaba la calidad de un acero por la proporción y el tamaño de las partículas de carbono en el interior del hierro, lo que se estimaba midiendo el tamaño medio de las inclusiones no metálicas en el hierro y su cantidad relativa en la aleación. Así, la industria del acero había creado una serie de patrones de calidad que relacionaban estas características estructurales con las propiedades fisicoquímicas del material y que se vendían a precios diferentes.

Para llevar a cabo la estima de las características estructurales se seguía el protocolo de trabajo largo y tedioso del método de la pesada (véase capítulo 2). Para la determinación del contenido de carbón de las muestras de acero, los técnicos del laboratorio ya contaban con una herramienta inestimable. Basándose en la propuesta de Delesse (1847), que se refiere a que «en un sólido bifásico, la proporción del área que ocupa una fase en una sección es igual a la fracción de volumen que ocupa la misma materia en el conjunto del sólido», los técnicos podían extrapolar el resultado del análisis de una muestra a todo el acero de ese lote. Por tal principio, era suficiente determinar qué proporción de la imagen microscópica estaba ocupada por el carbono y cuál estaba ocupada por el hierro.

A pesar de que el problema se resolvía adecuadamente, el método era muy lento porque la validación de los datos suponía un largo proceso de fotografiado, revelado, recortado y pesado, repitiendo la operación tantas veces como fuera necesario, tomando un cierto número de campos microscópicos, para validar estadísticamente los resultados. La seguridad del dato dependía del número de repeticiones, por lo que a la fiabilidad se le oponía la laboriosidad.

Para simplificar el proceso, la industria siderúrgica utilizaba un método alternativo generalizado que consistía en la comparación de fotografías de secciones de acero con una serie de plantillas de calidad conocida. Un grupo de técnicos especializados se encargaba de diagnosticar la calidad, lo que traía como consecuencia importantes diferencias entre centros de producción y entre técnicos de cada planta, debido a lo mucho de pericia y subjetividad que encerraba el método. Por tal motivo, y para evitar reclamaciones de los clientes, se solía rebajar la calidad final declarada, lo que traía aparejado pérdidas económicas importantes ya que se vendían aceros de calidades superiores como aceros de menor calidad. Este hecho fue lo que impulsó la investigación de métodos de análisis que permitiesen determinar las calidades de los aceros de la manera más objetiva posible; una importante coincidencia que completó el escenario necesario para la entrada de los primeros métodos analíticos de la imagen fue la aparición de la televisión y su incorporación a la instrumentación científica.

Teniendo en cuenta los avances que se han ido sucediendo en la técnica y el pensamiento científico, la historia del análisis de imagen se puede dividir en tres fases y unos prolegómenos.

Los prolegómenos se pueden situar alrededor de los años 50, cuando la televisión aún no había acabado de entrar en las aplicaciones tecnológicas. En aquel marco tecnológico surge el primer aparato para el análisis de imagen, basado en un sensor móvil que podía recorrer una fotografía dando saltos al azar. El sensor registraba los niveles de luz de los diversos puntos tomados aleatoriamente (por esta particular forma de trabajar se denominó flying spot, punto volante, a esta técnica de análisis). La probabilidad de que el punto volante registrase un campo oscuro u otro claro era proporcional a la fracción de área ocupada por la parte oscura y la parte clara de la imagen.

3.2 Los primeros analizadores

La primera fase histórica comenzó cuando la casa Metals Research Ltd sacó al mercado el equipo llamado Quantitative Television Microscope model A (abreviado como Quantimet A o QTM A). El avance que presentaba este equipo respecto al flying spot era la incorporación de un sistema de televisión; esto aceleraba notablemente el proceso de medida del contenido de incrustaciones metálicas, ya que la imagen se transfería mediante una cámara de vídeo desde el microscopio al televisor, con lo que se ahorraba el largo proceso fotográfico requerido con anterioridad. Las imágenes microscópicas se podían medir directamente sobre la misma pantalla.

El sistema se complicó al dotar al equipo QTM A de una memoria en la que mantener almacenada cierta información perteneciente a la imagen captada por la cámara. El nuevo modelo, llamado QTM B es, en cierta manera, el auténtico pionero de los modernos sistemas de análisis de imagen.

La forma de trabajar de estos revolucionarios modelos era rudimentaria, aunque eficaz. La utilización de la pantalla de televisión permitía eliminar el sensor móvil del flying spot, utilizando el propio mecanismo de barrido del tubo de rayos catódicos de la pantalla para medir el nivel de iluminación de los puntos de la imagen. La incorporación de la memoria permitió comparar una línea con la siguiente, al posibilitar almacenar la información de la primera línea de barrido antes de realizar el barrido de la siguiente. El cambio brusco de luz a oscuridad indicaba una transición de fase (un «evento» en la terminología de la época). Cuando dos eventos se encontraban separados el tiempo aproximado que tardaba el sensor en recorrer una línea completa, se podría considerar que se encontraba ante el borde de un objeto; igualmente, la altura del objeto podría ser medida como el número de líneas contiguas en el que aparecía el mismo evento.

El problema que se planteaba con QTM B era que los objetos de forma estrellada se contaban tantas veces como puntas tenía la estrella, con lo que se hacía una sobrevaloración del número de cuerpos oscuros presentes en la muestra.

A pesar de las limitaciones se llegaron a vender más de dos mil unidades, mayoritariamente en el sector siderometalúrgico.

Hacia el año 1968 las casas alemanas Leitz y Zeiss sacaron al mercado sendos equipos analógicos, Clasimat y MicroVideomat, que resolvían parcialmente el problema de las puntas de las estrellas mediante una nueva técnica que denominaron recuento topológico de objetos: mientras los objetos no presentasen agujeros en su interior, se contaban como elementos con independencia de su forma externa.

Al año siguiente la compañía norteamericana Bausch & Lomb sacó al mercado el analizador QMS, que era capaz de almacenar en memoria una imagen completa, a pesar de que la memoria de un ordenador de entonces no tenía capacidad para acumular una imagen en blanco y negro. Lo que hacía QMS era almacenar en la memoria las coordenadas (el número de línea vertical y tiempo desde el inicio de la línea) de los puntos en los que se producía transición brusca de claroscuro, o viceversa, es decir, un evento. Además, QMS incorporaba un lápiz óptico que permitía señalar sobre la pantalla un punto para marcar el objeto al que pertenecía u obtener cualquier información de dicho punto.

3.3 La era de la digitalización

Los avances se sucedían precipitadamente en estas fechas, tanto más para competir con un producto que aún estaba por perfeccionar que por acaparar un mercado todavía no preparado para absorber el gran coste económico que suponía un equipo de análisis de imagen. De esta manera, a finales de 1969 la compañía Metals Research Ltd comercializó el modelo Quantimet 720 que incorporaba un sistema especial de barrido del sensor óptico, con un cristal oscilante que hacía que el sensor avanzara a saltos de una longitud igual a la amplitud del campo de medida del propio sensor. Eso hacía que la imagen de estudio resultante fuese una especie de mosaico constituido por una serie de unidades mínimas de tamaño conocido y geometría cuadrada, que se llamó pixel (procedente del término ingles picture element).

Aunque en aquel año los requerimientos técnicos necesarios para almacenar en memoria una imagen compuesta por la adición de centenares de píxeles con muy diversos niveles de gris era algo inalcanzable, este intento fue la base de la digitalización de la imagen, que ha llegado a convertirse en la manera corriente de trabajo de cualquier sistema actual de análisis de imagen. Hasta entonces, todas las medidas que se realizaban de una imagen fotográfica o procedente de vídeo se realizaban respecto al conjunto de la imagen; es decir, se podía determinar la porción de área ocupada por una fase determinada o el número de objetos que constituían una fase concreta (los objetos oscuros, por ejemplo). Gracias a la digitalización y al abaratamiento de los componentes de memoria de los ordenadores se pudieron desarrollar operaciones que permitían tomar diversas medidas de objetos individuales dentro de las imágenes y almacenar las medidas de los objetos separadamente. Esto supuso el inicio de una importante herramienta para el reconocimiento de los objetos basada en sus características morfológicas.

Aquella novedad dio paso a otras potentes herramientas, diseñadas para el análisis de texturas y la identificación de los objetos, que se denominaron morfología matemática, y que se basaban en la evolución de las imágenes binarias.

La irrupción de la casa Joyce-Loebl con su equipo Magiscan supuso la incorporación a la estructura física del ordenador de muchas de las funciones que hasta entonces eran controladas a través de programas.

Fig. 3.1 Magiscan (versión de 1982).

3.4 La expansión de la memoria y el tratamiento de grises

A comienzos de los años 80, la firma alemana Kontron desarrolló un sistema de análisis de imagen que incluía el digitalizador como parte de los periféricos del sistema. Aquella máquina, el IBAS (acrónimo de Imagen Build Analisys System), supuso un antes y un después en el mundo de análisis. Hasta hoy en día los sistemas incluyen sistemáticamente dos criterios que provienen de aquel modelo: la digitalización como parte de la arquitectura del sistema y la definición de la paleta de color como apoyo, en forma de máscaras, a la segmentación binaria. Diversas casas comerciales comienzan a mejorar sus equipos en los años 80 como resultado del importante abaratamiento de los componentes informáticos. La profundidad de la imagen creció hasta seis y ocho bits, con lo que se podían representar las imágenes hasta con 256 niveles de gris e, incluso, almacenar en memoria cuatro, ocho o más imágenes simultáneamente.

Gracias a las innovaciones técnicas se desarrollaron algoritmos para el manejo de los niveles de gris que permitían clasificar los objetos por sus características cromáticas y los niveles de iluminación, además de por sus características morfológicas.

Fig. 3.2 Modelo IBAS2000 de KONTRON (versión de 1986).

Estamos trabajando, en el momento actual, con sistemas de análisis de imagen semejantes al modelo IBAS de Kontron, con las mejoras técnicas de nueva factura que ha permitido la microinformática, la miniaturización y la muy alta velocidad de los nuevos procesadores integrados. Ahora debemos enfrentarnos a los nuevos soportes de almacenamiento de la información; la digitalización de la imagen se está apoderando de los más simples sistemas de captura debido a que las nuevas cámaras de fotografía digital ya son un hecho corriente en la instrumentación biológica. Las nuevas imágenes son cada vez más voluminosas por la mejora en la resolución y el abaratamiento de los equipos, lo que está obligando a que los sistemas de almacenamiento de datos sean, a su vez, cada vez más grandes.

Fig. 3.3 Quantimet 600 de Leica (modelo de 1992).

3.5 Lo analógico y lo digital

3.5.1 Sistemas de referencia

Si tuviésemos que representar una imagen como una función matemática, deberíamos utilizar una función multidimensional. Considerando una imagen plana típicamente biológica, como es una imagen microscópica, cualquier punto de la imagen vendría caracterizado por su posición en el plano (sus coordenadas cartesianas respecto al origen), el brillo y el color de ese punto. Los biólogos utilizan un sistema de coordenadas en el plano para localizar un punto de interés en una muestra microscópica; de esa manera se le puede indicar a un colega una referencia con la que localizar la misma cosa cuando mira por el microscopio. Generalmente, las platinas de soporte de las preparaciones llevan adosadas una regla tipo nonius con el que calcular las coordenadas. Pero el brillo y el color acaban siendo una apreciación del observador y, para evitar vericuetos lingüísticos, los biólogos han desarrollado una jerga propia repleta de términos científicos.

Nosotros podemos utilizar ese mismo criterio para referirnos a las imá-genes. Se trata de aceptar un sistema de referencia, con una unidad de medida estándar que nos permita indicar cuántas unidades hay que desplazarse desde el origen en cada uno de los ejes para apuntar directamente a la región del punto. Si pudiésemos utilizar cualquier unidad de referencia para marcar las coordenadas, es claro que tendríamos tanta más precisión cuanto menor fuese el tamaño de la unidad de referencia. Así, no es lo mismo buscar el punto en la coordenada x=5 milímetros, sabiendo que la estructura más próxima que se puede marcar en ese eje se encuentra en la coordenada x=6 milímetros, que marcar coordenadas contiguas separadas entre sí por décimas de milímetro, de manera que entre el punto x=5 y x=6 haya nueve unidades de coordenada de diferencia. Esta preocupación por las magnitudes está muy agudizada en los microscopistas porque, de hecho, la limitación ante la que se encuentran inermes es la resolución de su instrumento de medida: el poder separador del microscopio. Pero saben que, con equipos más potentes, un punto que se encuentra en una coordenada (x, y) puede convertirse en dos elementos distintos

Por el momento dejaremos el problema que plantean el brillo y el color, pero bástenos decir por ahora que, sea cual sea la forma de medir estas dos características, su precisión también dependerá de la medida de referencia que utilicemos para ello.

3.5.2 Analógico/Digital

Hemos de hacer notar que con la obtención de la medida reducimos la propiedad estudiada a números, a un conjunto de dígitos, y que la expresión numérica de la cualidad supone la pérdida de información, en el sentido de que, en realidad, no podemos más que aproximarnos a la dimensión real del objeto.

Se entiende como analógico todo aquello que es susceptible de ser expresado con infinita exactitud, en función de la exactitud del instrumento de medida.

Por el contrario entendemos como digital todo aquello que se expresa en forma discreta, de manera que los saltos de magnitud son cantidades definidas. Entre dos estados contiguos no puede haber otro intermedio menor de un cuanto. Los relojes digitales se llaman así porque ésta es la forma que tienen de presentar la hora: los seis dígitos que muestran en su visor nos proporcionan la hora segundo a segundo; la unidad de tiempo «un segundo» es el menor cuanto de medida posible.

El clásico reloj de manecillas que mantiene las agujas en constante movimiento podría aportarnos la hora con precisión infinita, si fuésemos capaces de percibirla adecuadamente con nuestros sentidos. Estos últimos se llaman relojes analógicos.

En general, los fenómenos reales que nos rodean se pueden expresar como magnitudes analógicas. En ellos la precisión depende en gran medida del observador.

En el caso de la imagen, cualquiera de ellas que podamos analizar con el sistema binario ojo - cerebro, cualquier imagen real es captada por el ojo como una imagen analógica. Los matices captados son infinitos y son susceptibles de ser interpretados una y otra vez, especialmente el color de los objetos y la definición de sus perímetros.

Cuando la imagen es captada por un dispositivo electrónico, como una cámara de vídeo, los objetos comienzan a ser visibles cuando reflejan una luz suficientemente intensa como para excitar el material fotosensible de la cámara. Los objetos más brillantes que se pueden captar son aquellos que reflejan una cantidad de luz capaz de saturar la respuesta del elemento fotosensible. Para la mente humana que ha construido la cámara, es lógico que existan dos umbrales fuera de los cuales la luz no es capaz de producir cambios en la excitación de sus sensores lumínicos. Evidentemente, estos límites dependen en gran medida de la calidad de los materiales con los que se construyó la cámara.

La arquitectura de los sistemas de captación de imagen por vídeo impone una limitación capital, en lo que se refiere al rango de intensidades que la cámara puede captar. La cámara es capaz de captar luz de diversa intensidad. Cada vez que incide un «rayo de luz» sobre el sensor se genera un impulso eléctrico en la cámara cuya intensidad es equivalente a la intensidad de la luz incidente. La sensibilidad de la cámara se puede expresar en términos de cuáles son las diferencias mínimas de matiz que la cámara puede representar sobre una pantalla de televisión.

Así pues, tenemos:

1 un umbral inferior, por debajo del cual el sistema de captación no resulta estimulado y nosotros no tenemos imagen visible sino una pantalla en negro;

2 un límite superior, por encima del cual es indiferente que la intensidad de luz sea mayor que dicho límite; y, evidentemente,

3 un rango de intensidades comprendido entre el umbral y el límite superior que la cámara puede distinguir como estados distintos.

El umbral determina la sensibilidad de la cámara; al límite superior le denominaremos saturación; y el rango expresa la profundidad, puesto que determina con qué diferencias de matiz captamos la luz incidente.

3.5.3 El píxel

Hasta ahora nos estamos moviendo entre conceptos de tipo analógico, ya que los matices de luz que llegan a la cámara pueden ser infinitos y dependen únicamente de la propia luz que refleja cada objeto. La luz que incide sobre el sensor fotosensible de la cámara genera impulsos eléctricos de intensidades equivalentes a la de la luz. Los impulsos se transmiten por un cable y provocan el encendido de las pantallas de televisión. Y es aquí donde se encuentra el factor crítico para la representación de la imagen. En efecto, la primera limitación proviene de la estructura de la cámara; la captación de la imagen se produce en una placa constituida por un gran número de sensores puntuales, ordenados en filas y columnas. Los sensores analizan e integran la luz procedente de un sector del cuadrado de imagen que se está enfocando, y cada sector se representa en la pantalla de TV con una intensidad igual a la que la cámara envió al ser excitada por la luz.

La representación se puede aclarar con el siguiente ejemplo: el objetivo de la cámara «ve» un trozo de mundo rectangular, pongamos de 100x200 metros de lados, de manera que para poder contener una copia miniaturizada, divide la imagen real en cuadrados de 1x1 metros; cada cuadrado en el que se ha subdivi-dido la imagen recibe la luz correspondiente y manda una intensidad de corriente equivalente a la cantidad de luz de su cuadrado; la señal se manda al televisor, que tiene, al menos, tantos puntos como aquellos en los que se ha dividido la imagen, que se encienden con una intensidad equivalente y que nos permiten ver representada la imagen en la pantalla.

Cada uno de los puntos de información en los que hemos dividido la imagen le llamamos «píxel»; y lo podremos definir como la mínima fracción de información con la que podemos representar una imagen.

La resolución de los instrumentos de captación y representación (cámara y TV) depende exclusivamente del fabricante, con lo que serán tanto más precisos cuantos más puntos (píxeles) tengan para representar la imagen.

En lo tocante a la intensidad eléctrica en la que se traduce la intensidad lumínica, también depende del fabricante y, ya se ha dicho, viene caracterizada por el umbral, la saturación y el rango. Se entenderá que, si tomamos como valor cero (0) a la intensidad umbral y cien (100) al límite superior, y que el televisor no es capaz de mostrar diferencias de luz sino cuando hay una unidad entera de intensidad entre dos valores contiguos, tendremos un rango de 101 niveles distintos de intensidad. Así, el cero será negro, el 100 será blanco y el cincuenta gris. Según vayamos hacia el cero encontraremos los puntos más oscuros y cuando nos acerquemos al valor 100, encontraremos los puntos más claros.

Ahora podemos expresarnos de otra manera. Cada píxel estará iluminado con una intensidad entre cero y cien y la imagen puede escribirse en un papel poniendo 100 columnas de números en doscientas filas, de manera que los valores de esos números variarán entre cero y cien.

Cualquier ejemplo valdría, si tenemos en cuenta que la imagen es descompuesta, al ser captada, en cuadrados de información, píxeles, y que la información que contiene cada cuadrado se encuentra entre el umbral y el límite superior de sensibilidad de la cámara; el rango y el límite superior son números arbitrarios que representan dichas intensidades y que tienen su expresión lumínica en el encendido de los correspondientes píxeles de las pantallas de televisión.

Tal y como hemos expresado el problema, se podrá decir que la información de la imagen se puede expresar como una matriz (así se define una secuencia ordenada de números en filas y columnas), en la que el valor de cada elemento de ella se encuentra comprendido entre el umbral y el límite superior y dos números contiguos manifestarán una diferencia igual al salto mínimo de sensibilidad.

Como se podrá ver, la imagen real se está representando enteramente en forma de números, de dígitos. Ya no es la imagen real, porque el trasiego de información ha comenzado por dividir la imagen en cuadrados que hemos considerado equivalentes y que, por lo tanto, la intensidad de la luz que representa a cada cuadrado es el valor promedio. Pero la imagen está apareciendo en la pantalla del televisor, aunque sabemos que cuando la imagen viaja desde el fotomultiplicador de la cámara al aparato de televisión, lo está haciendo como una secuencia de números; esto es, se desplaza como dígitos: está digitalizada.

Quizá hayamos dado una gran vuelta para llegar aquí, pero el concepto de digitalización lleva implícito:

1 la representación numérica de la información;

2 la simplificación, o la pérdida, de información en el proceso;

3 la representación de la información a través de un nuevo código, arbitrario;

4 la reproducibilidad de la imagen sin pérdidas de calidad.

El instrumento que realiza el paso de imagen real a digitalizada, lo llamamos digitalizador y, evidentemente, digitalización será el proceso en sí.