Kitabı oku: «La criptología de la enfermedad», sayfa 10

La importancia del papel de filtro en el desarrollo del tamizaje

Robert Guthrie solía decir en sus entrevistas que su contribución más importante no había sido el método microbiológico para medir fenilalanina y otros aminoácidos y azúcares, sino haber ideado la toma de la muestra de sangre seca en papel de filtro (6). En la sangre recogida en papel de filtro, secada lentamente al aire y conservada en lugar seco y protegida de la luz, muchos de los componentes se mantienen estables durante varios meses, y para ciertos analitos hasta por varios años.

Poco después de que se publicaran los datos iniciales de Guthrie sobre el tamizaje para fenilcetonuria, Scheel y Berry analizaron 95 niños y reportaron una alta incidencia de falsos positivos en comparación con los datos de Guthrie, a lo que él replicó que aun cuando no se podía tener certeza acerca de las causas de las discrepancias, una de las posibles razones podía ser la diferencia en el papel de filtro usado para la toma de la muestra. Anotaba también, que para que el resultado fuera reproducible, era necesario que la mancha de sangre utilizada fuera del mismo tamaño, para que contuviera la misma cantidad de sangre (11). Este método para recoger y mantener la sangre hizo posible que las muestras fuesen remitidas para ser analizadas en otros Estados o países y centralizar los servicios de tamizaje en laboratorios de referencia muy especializados, que se dedican solo a tamizaje y alcanzan gran experiencia y, por ende, mayor calidad en los análisis. Esos laboratorios centralizados prestan servicios a otros Estados y regiones que no tienen las condiciones para realizar el tamizaje adecuadamente. También ha sido posible disminuir los costos, puesto que los grandes volúmenes permiten realizar economías de escala.

Dependiendo del calibre del papel de filtro, es decir, su textura y grosor, la cantidad de sangre que absorbe será mayor o menor. Para tener resultados reproducibles y que las concentraciones de las sustancias de la sangre se puedan cuantificar con exactitud, se requiere que el calibre y calidad del papel sean homogéneos y que la cantidad sea uniforme. Inicialmente el papel de filtro era cortado con un perforador de los que se usa en las oficinas para hacer huecos en las hojas de papel. Una persona ingeniosa en el Saint Joseph Hospital, en Los Ángeles, Mr. Robert Phillips, desarrolló una máquina para automatizar las perforaciones, y cuando se la mostró a Guthrie, él le sugirió que la modificara para hacer cuatro perforaciones en una sola mancha de sangre. El inventor disminuyó el tamaño de las perforaciones para tener las cuatro manchas que corresponden a cuatro muestras en una sola tarjeta de las que se usa para tamizaje. Guthrie adaptó y estandarizó la prueba para esos volúmenes más pequeños de muestra (3).

Es importante anotar que el papel usado en la actualidad no es igual al papel de filtro usado por Guthrie, este fue mejorando hasta hacer su superficie más homogénea, de forma tal que los resultados obtenidos al usar una fracción del mismo tamaño sean cuantitativamente reproducibles en cualquier parte del papel, y que los diferentes lotes de papel sean también homogéneos. Algunas pruebas que antes eran consideradas como de tamizaje ya son suficientemente confiables para diagnóstico, gracias —en gran medida— a los adelantos en la estandarización de la manufactura del papel para la toma de la muestra. El Centro para el Control de Enfermedades de Atlanta (CDC) publicó guías para la recolección de las muestras, pues aunque es un procedimiento sencillo, debe hacerse cuidadosamente para obtener resultados que se puedan cuantificar en forma confiable (12). Hoy en día, además del CDC, existen programas de control de calidad de las sociedades científicas que recomiendan el tipo y calibre del papel necesarios para garantizar resultados exactos y reproducibles. Este mismo método de recolección de sangre permite la determinación de las mutaciones para los errores innatos del metabolismo, usando pruebas moleculares (12, 13).

Tamizaje para hipotiroidismo

El hipotiroidismo congénito es un desorden ampliamente distribuido en el mundo. Se calcula que ocurre aproximadamente en 1:3000 a 1:4000 recién nacidos. Es una de las causas más comunes de discapacidad cognitiva prevenible (13). Al hipotiroidismo no tratado se le ha conocido como cretinismo. La mayoría de los niños que nacen con hipotiroidismo no muestran signos clínicos al nacimiento y la demora en el diagnóstico y en el inicio del tratamiento lleva a discapacidad cognitiva severa y otras anomalías como la disminución del sentido del gusto y del olfato, fatiga, dolores musculares y articulares, debilidad y aumento de peso.

La glándula tiroides sintetiza dos hormonas que regulan el metabolismo, la T4 y la T3. La T3 es la más activa, pero la T4 se considera como su precursor. La producción de la T4 está bajo el control de la hipófisis que segrega la hormona tirotropina (TSH). La liberación de TSH depende a su vez de la hormona estimulante de la hipófisis (TRH), la cual es sintetizada por el hipotálamo. Cuando los niveles de T4 disminuyen, aumenta la síntesis de TSH, cuya función es estimular la tiroides para que produzca más hormonas T4 y T3. Por lo tanto, el hipotiroidismo puede ser causado por defecto en el hipotálamo, la hipófisis o en la misma glándula tiroides. La gran mayoría de los casos de hipotiroidismo se deben a un defecto en la propia glándula tiroides: se le denomina hipotiroidismo primario (figura 4-1).

Sir William Gull en el año 1873 fue el primero en reconocer que el mixedema^IV era causado por una atrofia de la glándula tiroides. Bruch y McCune reportaron en 1944 el beneficio para el desarrollo mental de niños hipotiroideos que recibieron hormona T4 sintetizada químicamente, un medicamento muy económico y además efectivo, pues al igual que la hormona natural, se convierte en T3 en los tejidos periféricos (14).

Klein, Meltzer y Kenny en 1972 documentaron que el tratamiento antes de los tres meses de edad mejora el pronóstico para el desarrollo mental en los infantes con hipotiroidismo congénito; también mostraron que el daño cerebral era irreversible si el tratamiento no se inicia antes de los tres meses. Dada la alta prevalencia y las secuelas graves que produce el hipotiroidismo en los pacientes no tratados, era razonable intentar detectarlo en el recién nacido e iniciar el tratamiento antes de que se presente la sintomatología (15).

Aunque el tratamiento con T4 es muy efectivo, económico y estaba disponible hacía muchos años, su tamizaje en el recién nacido se introdujo solo entre 1975 y 1976, debido a que no se había inventado una prueba sensible y confiable para realizarlo. Esta se logró usando anticuerpos, que son moléculas que sintetiza el cuerpo humano para defenderse de partículas o de moléculas que le son extrañas. Los anticuerpos reconocen muy específicamente cualquier molécula. El concepto fue propuesto desde 1890 por Emil von Behring^V y Kitasato Shibasaburo, quienes describieron la actividad de las “antitoxinas” contra difteria y tétanos.

Figura 4-1. Control del metabolismo de la tiroides. Cuando hay baja producción de las hormonas tiroxina (T4) y triyodotironina (T3), estas retroalimentan al hipotálamo y la hipófisis para que segreguen sus hormonas estimuladoras: el TRH (hormona liberadora de la tirotropina) y la tirotropina (TSH). Si el nivel de T4 baja en el suero, el de TSH sube y viceversa. Con el signo (-) se señalan sustancias que actúan negativamente sobre la producción de las hormonas tiroideas. Con el signo (+), las sustancias estimuladoras I^-=(yodo). Somatostatina u hormona del crecimiento.

Paul Ehrlich, hacia 1891, formuló la hipótesis de que cuando un patógeno o una molécula invade al organismo humano o a los animales superiores, estos, para su defensa, producen unas moléculas muy específicas que llamó “Antikorper” (anticuerpo). Propuso la teoría selectiva o de especificidad de los anticuerpos usando la analogía de que un anticuerpo se une a la molécula invasora para neutralizarla en una forma tan específica como una llave encaja en su cerradura.^VI

Las moléculas que inducen la producción de los anticuerpos se denominan antígenos. La respuesta del animal en el que se inyecta el antígeno, o sea, la molécula que no le es propia, era mayor cuando la molécula era compleja, no solo por su tamaño sino por su composición química. Un anticuerpo se obtiene inyectando en un animal como el conejo las moléculas que nos interesa medir, como insulina, hormonas tiroideas, hormona del crecimiento, proteínas de una bacteria, etc. El animal se defiende produciendo anticuerpos, que, como ya se dijo, son proteínas muy específicas que reconocen y neutralizan a la molécula agresora. Por lo tanto, para usarlos como reactivos, se purifican los anticuerpos de la sangre del conejo, en nuestro caso. La producción de anticuerpos es muy efectiva contra las moléculas grandes, como la hormona del crecimiento o la albúmina; no así con moléculas pequeñas como la hormona de la tiroides T4, que se deriva del aminoácido fenilalanina y tiene una masa molecular cincuenta veces más pequeña que una proteína no muy grande. Para aumentar la inmunogenicidad frente a las moléculas pequeñas, se inyecta el antígeno con una mezcla de aceite y agua, alúmina, liposomas, microesferas u otras moléculas llamadas coadyuvantes, que aumentan la reacción del animal ante la sustancia extraña.

Rosalyn Yalow (1921-2011). Recibió el Premio Nobel en 1977 por el desarrollo del radioinmunoensayo para las hormonas peptídicas.

Rosalyn Yalow es un modelo muy positivo de la defensa de los derechos de la mujer. Autodeclarada feminista, trabajó en la Universidad de Illinois, siendo una entre más de 4000 profesores, de quienes ganó respeto y admiración. No le fue fácil ingresar a hacer sus estudios superiores en física por ser mujer y judía; inclusive, para ingresar al posgrado en física, tuvo que aceptar un cargo de secretaria del jefe de departamento, quien le puso como condición que aprendiera taquigrafía. Yalow decía que: “Cualquier cosa que haga la mujer debe hacerlo dos veces mejor que un hombre para que sea considerada la mitad de buena”. Yalow era ferviente admiradora de madame Curie y recomendaba que todas las mujeres que aspiraran a ser científicas deberían leer su biografía. Ambas científicas compartieron rasgos de vida muy similares.

El desarrollo del radioinmunoensayo (RIA)

Para poder usar los anticuerpos en la identificación de moléculas —grandes o pequeñas— era necesario acoplarlos a sustancias coloreadas o de otra índole que se pudieran medir fácilmente, y que tuvieran una alta sensibilidad para poder medir las concentraciones muy pequeñas de las hormonas sanguíneas.

Rosalyn Yalow, una física nuclear, y Solomon Berson, médico en el Hospital de Veteranos de Nueva York, desarrollaron a mediados de los años 50 el método de radioinmunoensayo para cuantificar hormonas u otras sustancias que se encuentran en concentraciones muy pequeñas. Por ejemplo, para medir en sangre la ACTH,^VII una hormona que libera la glándula pituitaria, usando radioinmunoensayo se necesitaban solo unos pocos microlitros de suero sanguíneo. A Yalow se le otorgó la mitad del premio, Solomon Berson murió en 1972. Si hubiera estado vivo, seguramente también hubiera compartido el Premio Nobel. La otra mitad se repartió entre Roger Guillemin y Andrew Schally por sus descubrimientos relativos a la producción de hormonas peptídicas en el cerebro.

En el radioinmunoensayo, en su versión más simple se marca con yodo radioactivo la molécula que se quiere medir; por ejemplo, para medir la T4 en sangre, se mezcla una cantidad determinada de esa molécula marcada radioactivamente con el suero que contiene la T4 del suero y se agrega el anticuerpo. Como las dos hormonas, marcada y no marcada, son equivalentes, entre más hormona hay en el suero de la persona, menos hormona marcada, se unirá al anticuerpo, es decir, la cantidad de radiactividad ligada será inversamente proporcional a la hormona presente en el suero.

Aplicación del radioinmunoensayo para el tamizaje del hipotiroidismo

El hipotiroidismo congénito se conoce desde hace muchos años; produce discapacidad cognitiva severa y otras manifestaciones como piel seca y fría, caída del cabello, ganancia de peso, intolerancia al frío, fatiga, etc. Thomas Curling, en 1850, describió un niño con manifestaciones de hipotiroidismo congénito, a quien en la autopsia no se le encontró glándula tiroides. William Osler, el padre de la medicina moderna, relacionó la deficiencia de la función tiroidea y los cambios característicos encontrados en el cretinismo esporádico. Osler hacia énfasis en que se debía escuchar al paciente porque este le dictaba el diagnóstico al médico. Anecdóticamente se cuenta que una vez en MacGill entró a ver un paciente que no estaba en la cama y sin verlo preguntó a los estudiantes: “¿Dónde está el paciente hipotiroideo?” ¿Cómo llegó Osler al diagnóstico en ausencia del paciente? La respuesta es: sobre la cama tenía cobijas extras para el frío, había mucho pelo en la almohada y sus ropas eran de una persona obesa. Todas, características del hipotiroidismo. La clínica del hipotiroidismo se conocía y ya había métodos para cuantificar la hormona pero se requería un método específico, sensible y fácil de automatizar para cuantificar estas hormonas pequeñas pues a diferencia de la insulina y la hormona del crecimiento, que son proteínas, las hormonas tiroideas son moléculas derivadas de un solo aminoácido

A comienzos de la década de los 70, en la Universidad de California, en Los Ángeles, Inder J. Chopra, usando las técnicas inventadas por Yalow y Bateson, desarrolló el radioinmunoensayo para T3 y T4 (16, 17).

Jean H. Dussault, médico canadiense que trabajaba con Robert Volpe en la trasferencia de T3 en placenta, fue a entrenarse en California en el laboratorio de D.

A. Fischer, en el uso de ovejas como modelo experimental para hipotiroidismo, y allí fue compañero de Chopra. Cuando Dussault regresaba a Canadá en el año de 1970, recibió como regalo de despedida anticuerpos para T3, T4 y TSH.

La enfermedad es difícil de diagnosticar clínicamente en los primeros días, pero como se mencionó, tiene la ventaja de que los efectos se pueden detener y reversar en su mayoría si el paciente se trata tempranamente con L-tiroxina, por lo tanto, Dussault pensó que era una enfermedad ideal para ser tamizada en los recién nacidos. Una afortunada circunstancia le ocurrió a su arribo a Montreal, se le asignó un laboratorio ubicado cerca al laboratorio regional donde se estaba haciendo tamizaje para fenilcetonuria y tirosinemia, usando muestras en papel de filtro. Conjuntamente con sus colaboradores, durante 1971 y 1972 se dedicaron a desarrollar un método de radioinmunoensayo para T4 en papel de filtro. Dicho método no fue aceptado para ser presentado en la reunión de la Sociedad de Endocrinología en 1972, pero fue divulgado posteriormente en una reunión local en Quebec y luego en la Sociedad Canadiense de Investigación Clínica en 1973 (18).

Lo primero que debían decidir era si se iba a hacer la prueba en sangre total tomada en papel de filtro o en suero; por razones de conveniencia se escogió la sangre tomada del talón en papel de filtro. Ese año tamizaron 30 000 muestras y encontraron cuatro casos de hipotiroidismo. Los resultados fueron sometidos para su publicación en Clinical Chemistry y en la New England Journal of Medicine. No fueron aceptados por considerarlos irrelevantes, por lo que se divulgaron en una publicación de menor circulación, en francés. En el año de 1974, el método comenzó a ser solicitado y en la provincia de Quebec (Canadá) el tamizaje de hipotiroidismo se adicionó a los de fenilcetonuria y tirosinemia (18).

Después de que el estudio fue publicado en la Journal of Pediatrics, William Murphey, Ph. D., inició programas en Nueva Inglaterra, Oregón (Estados Unidos), y en Francia. Dussault y colaboradores desarrollaron también métodos para determinar TSH y TBG-tiroglobulina, que dan indicación de la T4 libre en sangre, la fracción realmente activa, pues la ligada a proteínas no lo es.

Otra decisión importante que se debía tomar era si para el tamizaje se debía medir T4 total o TSH. Como ya vimos en el hipotiroidismo la T4 se encuentra disminuida y la TSH está elevada; en teoría, la TSH, que es una proteína, es más específica y fácil de medir. Luego de algunas publicaciones que comparaban los resultados obtenidos midiendo T4 y TSH en que se encontraron tasas de falsos positivos similares, algunos países optaron por medir T4, en tanto que otros optaron por TSH, y algunos las dos simultáneamente (18-20).

Otra controversia se centró en el tiempo óptimo para la toma de muestra. Antes de las 24 horas en el recién nacido hay un incremento en TSH que regresa a la normalidad después de 48 horas, por lo tanto se recomendó que la muestra se tomara después de 48 horas (13, 21).

Jean Dussault (1941-2003). Nacido en la ciudad de Quebec en 1941. Endocrinólogo canadiense reconocido por sus grandes aportes al tamizaje neonatal. En el año 1972 publicó el método de radioinmunoensayo para detectar el hipotiroidismo en el recién nacido, con miras a evitar el retardo mental. Dussault se negó a patentar su invento para que fuera del dominio público y beneficiara un número mayor de personas, decisión que también compartieron sus colaboradores.

También se destaca su trabajo sobre los receptores de hormonas tiroideas y el efecto de las hormonas tiroideas en el desarrollo cerebral. Dussault lideró desde su laboratorio una importante generación de endocrinólogos y publicó más de 200 artículos acerca de sus investigaciones.

El hipotiroidismo en los recién nacidos es una de las causas de deficiencia cognitiva más frecuentes, fáciles y económicas de tratar. Por eso, junto con la fenilcetonuria es el tamizaje que se hace en un mayor número de países alrededor del mundo. Las pruebas de tamizaje se deben confirmar haciendo TSH y T4 libre en una muestra distinta, suero. Existe la posibilidad de hipotiroidismo transitorio por lo cual los pacientes se deben reevaluar a los 3 años.

La prueba de TSH permite identificar también el hipotiroidismo por defectos en la hipófisis y sospechar los producidos por defectos en el factor estimulante de la tiroides que se origina en el hipotálamo (figura 4-1), que, aunque son poco frecuentes, deben tenerse en cuenta en el diagnóstico diferencial del hipotiroidismo por defectos en la glándula tiroides.

Tamizaje de 50 enfermedades en una gota de sangre

En la actualidad, una gota de sangre tomada en papel de filtro se puede usar para tamizaje de más de 50 enfermedades usando espectrometría de masas en tándem.

Esta metodología fue desarrollada por David Millington, experto en espectrometría de masas, quien en 1990 llegó a trabajar en la Universidad de Duke. Allí se le pidió analizar una muestra de orina de un paciente con acidemia propiónica. Identificó un pico que correspondía a propionil carnitina,^VIII lo que indicaba que el método servía para identificar metabolitos presentes en la orina de pacientes afectados por acidemias orgánicas. Luego, por sugerencia de un colega médico, Steven Kahler, comenzó a usar la técnica en el diagnóstico de desórdenes de acidemias orgánicas y desórdenes de la oxidación de ácidos grasos en una sola gota de sangre (22); posteriormente se amplió para la determinación de algunos aminoácidos (23, 24) y después se amplió para tamizaje neonatal de EIM de azúcares y lípidos (25-27). Según Millington, lo que lo atrajo de esa tecnología es que se podía poner una muy pequeña cantidad del material en la máquina y en menos de cinco minutos se obtenía muchísima información acerca de su estructura.

En total en Estados Unidos para tamizaje neonatal se recomienda un panel básico de 34 enfermedades y un panel de blancos secundarios para más de 25 (28). Un hallazgo en el tamizaje se debe confirmar con otras pruebas como la cromatografía líquida, o la cromatografía de gas combinada con la espectrometría de masas GC/MS.

La muestra en sangre seca permite además el diagnóstico de muchas deficiencias enzimáticas, usando espectrometría de masas en tándem MS/MS (29–31). Se hace tamizaje por ejemplo para las mucopolisacaridosis, midiendo simultáneamente 4 o 5 enzimas para enfermedades en las cuales la clínica es muy semejante (30).