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2.1Atmungskette und ATP-Synthase
1 Bei welchen Schritten der Atmungskette wird ein Protonengradient über der inneren Mitochondrienmembran aufgebaut?

Während der Atmungskette werden Protonen entgegen ihres Konzentrationsgradienten über die innere Mitochondrienmembran transportiert. Dies geht nur unter Energieverbrauch. Die Redox-Reaktionen der Atmungskette sind exotherme Reaktionen, setzen also Energie frei. Diese frei werdende Energie muss größer sein als die Energie, die zur Translokation der Protonen benötigt wird. Anders ausgedrückt, das Redox-Potenzial der Reaktion muss größer sein als das chemiosmotische Potenzial der Protonen. Dies ist bei drei der vier Schritte der Elektronentransportkette der Fall:

Im Komplex I der mitochondrialen Elektronentransportkette werden die Elektronen des NADH/H+ in die Atmungskette eingeschleust und zugleich Protonen aus der Matrix in den Intermembranraum gepumpt.

Damit folgt die Reaktion an Komplex I folgender Gleichung:

NADH/H+red. + Qox. + 4 H+Matrix ↔ NAD+ox. + QH2red. + 4 H+Inter.

Dabei stellen Qox und QH2red die oxidierte und reduzierte Form des Co-Faktors Ubichinon (= Coenzym Q) dar. Die Energie, die bei der Redox-Reaktion von NADH/H+red. + Qox. zu NAD+ox. + QH2red frei wird (0,36 V bzw. 69,5 kJ/mol), wird in der Umlagerung von Protonen gespeichert. Vier Protonen aus der Mitochondrienmatrix (H+Matrix) werden in den Intermembranraum gepumpt (H+Inter).

Über den Komplex II werden die Elektronen der Reduktionsäquivalente FADH2 in die Atmungskette eingeschleust und auf Ubichinon übertragen. Die Potenzialdifferenz zwischen FADH2 und Ubichinon ist zu gering, als dass hinreichend Energie frei würde, um Protonen zu translozieren.

Im Komplex III werden die Elektronen von reduziertem Ubichinon auf Cytochrom c übertragen. Entsprechend wird dieser Komplex auch Ubichinon-Cytochrom-c-Oxidoreduktase oder Cytochrom-bc1-Komplex genannt. Über den mobilen Elektronentransporter Cytochrom c werden Elektronen von Komplex III auf Komplex IV übertragen. Da-bei werden Protonen aus der Matrix des Mitochondriums in den Intermembranraum gepumpt. Die Potenzialdifferenz beträgt hier 0,190 V, was 36,7 kJ/mol entspricht, also etwas mehr als der energiereichen Phosphat-Phosphat-Bindung in ATP.

Im Komplex IV werden die Elektronen von reduziertem Cytochrom auf molekularen Sauerstoff übertragen. Dabei wird Cytochrom oxidiert und der Komplex heißt entsprechend auch Cytochrom-Oxidase. Der Gesamtprozess lässt sich mit folgender Gleichung zusammenfassen:

4 Cytcred + 4 H+Matrix + O2 → 4 Cytcox + 2 H2O

Tatsächlich ist diese Reaktion in zahlreiche Teilschritte gegliedert. Dabei werden in den ersten Teilschritten die Elektronen über Cytochrome auf ein Kupferzentrum des Enzymkomplexes übertragen. Molekularer Sauerstoff wird koordinativ an ein reduziertes Zentraleisen einer Häm-Gruppe des Komplexes gebunden. Bei der anschließenden Reduktion des Sauerstoffs zu Wasser werden in der Mitochondrienma­trix Protonen verbraucht. Da diese Reaktion ausschließlich auf der Matrix-Seite abläuft, steigt der Protonengradient über der inneren Mitochondrienmembran. Insgesamt beträgt die frei werdende Energie bei den an Komplex IV katalysierten Reaktionen 112 kJ/mol.

2 Wo und wie blockieren die folgenden Inhibitoren/Gifte die Atmungskette:

 Cyanide

 Rotenon

 Dinitrophenol?

In der Atmungskette an der inneren Mitochondrienmembran werden die Elektronen der Reduktionsäquivalente NADH/H+ und FADH2 in einer Kaskade an Redox-Reaktionen sukzessiv auf molekularen Sauerstoff übertragen. Die dabei frei werdende Energie wird in einen Protonengradienten über der inneren Mitochondrienmembran umgewandelt. Die ATP-Synthase nutzt diesen Protonengradienten dergestalt, dass der Flux der Protonen durch einen Kanal innerhalb der ATP-Synthase Konformationsänderungen des Enzyms verursacht. Diese werden dazu genutzt, eine Phosphodiester-Bindung zwischen ADP und anorganischem Phosphat zu verknüpfen und somit neues ATP zu synthetisieren.

Die Elektronentransportkette (s. Abb. 2.1) besteht aus einem NADH-Dehydrogenase-Komplex (Komplex I), Ubichinon (CoQ), einem Cytochrom-bc1-Komplex (Komplex III), Cytochrom c und der Cytochrom-c-Oxidase (Komplex IV). Prinzipiell führt eine Hemmung an jedem dieser Schritte zum Erliegen der Atmungskette, also dazu, dass kein Protonengradient aufgebaut wird und damit zum Stopp der ATP-Neusynthese.

Abb. 2.1 Die Elektronen der Reduktionsäquivalente NADH/H+ werden über die NADH-Dehydrogenase in Komplex I in die Atmungskette eingeschleust. Bei der Übertragung der Elektronen auf Ubichinon (CoQ) werden Protonen aus der Mitochondrienmatrix in den Intermembranraum transportiert. Ebenso trägt die Übertragung der Elektronen durch den Komplex III von CoQ auf Cytochrom c und die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser an Komplex IV zum Aufbau eines Protonengradienten bei.

Cyanide hemmen die Cytochrom-c-Oxidase, also das Enzym, das für die Übertragung der Elektronen von Cytochrom c auf molekularen Sauerstoff sorgt (s. Abb. 2.2). Dabei binden Cyanide irreversibel an eines der drei redox-aktiven Metallzentren des Enzymkomplexes. Konkret binden Cyanide an das zentrale Eisenatom der prosthetischen Gruppe Häm a3 und verhindern damit die Reduktion des zentralen Eisenatoms von Fe3+ zu Fe2+. Damit kann diese prosthetische Gruppe keine koordinative Bindung mehr mit molekularem Sauerstoff eingehen. Der finale Elektronenakzeptor O2 steht damit nicht mehr zur Verfügung. Für Cyanid-Vergiftungen weniger relevant ist, dass auch die koordinative O2-Bindung an unserem Transportprotein Hämoglobin durch denselben Mechanismus inhibiert wird, damit insgesamt also die O2-Menge in peripherem Gewebe sinkt.

Rotenon entstammt dem Sekundärstoffwechsel einiger Leguminosen und hat strukturelle Ähnlichkeiten mit Ubichinon. Entsprechend blockiert es den NADH-Dehydrogenase-Komplex (Komplex I) und damit die Übertragung der Elektronen von NADH/H+ auf Ubichinon. Die Elektronen von NADH/H+ können zwar noch auf das Eisen-Schwefel-Zentrum von Komplex I übertragen werden, ihr weiterer Abfluss ist aber verhindert. Damit kann kein Protonengradient aufgebaut werden, und die Antriebskraft für die ATP-Synthase fehlt. Darüber hinaus führt ein Rückstau durch die Akkumulation der Reduktionsäquivalente NADH/H+ zum Erliegen oxidativer Stoffwechselreaktionen wie oxidative Decarboxylierungen, Citratzyklus und β-Oxidation.

Im Gegensatz zu den vorhergenannten Inhibitoren führt eine Vergiftung mit Dinitrophenol nicht zu einer „Verstopfung“ der Atmungskette (s. Abb. 2.2). Stattdessen sind bei einer Dinitrophenol-Vergiftung Protonengradient und ATP-Synthese entkoppelt. Die prinzipielle Wirkungsweise ist also, dass das chemiosmotische Potenzial des Protonengradienten über der inneren Mitochondrienmembran nicht mehr genutzt wird, um durch die ATP-Synthase neues ATP zu generieren, sondern dass diese Energie jetzt als Wärme ungenutzt verpufft. Dinitrophenol nimmt Protonen aus dem Intermembranraum auf, diffundiert protonenbeladen durch die innere mitochondriale Mem­bran in die Matrix und gibt dort die Protonen ab. Ähnliche Entkopplungsmechanismen werden auch bei der zitterfreien Thermogenese im braunen Fettgewebe von Säuglingen und Winterschläfern genutzt. Hier sorgt das Protein Thermogenin für die Entkopplung von Atmungskette und ATP-Synthese. Die physiologische Reaktion des Körpers auf eine Dinitrophenol-Vergiftung ist eine Erhöhung der Stoffwechselrate, um den Mangel an neu synthetisiertem ATP zu kompensieren. Diese Wirkung hat man sich lange Zeit zunutze gemacht, und Dinitrophenole waren als sogenannte „Schlankmacher“ auf dem Markt.

Abb. 2.2 Cytochrom c und Ubichinon sind wesentliche Bestandteile der Atmungskette; Cyanide und Dinitrophenol sind potente Inhibitoren der Atmungskette.

3 Was haben die Blockierung der Atmungskette durch Kohlenstoffmonoxid und die Blockierung des Sauerstofftransports durch Kohlenmonoxid gemeinsam?

Kohlenstoffmonoxid (CO) ist ein Atemgift. Da es farb- und geruchlos ist, erfolgt die Vergiftung meist unbemerkt. Die giftige Wirkung des CO beruht auf der Fähigkeit, Sauerstoff an seinen Bindungsstellen zu verdrängen. Besonders nachteilig wirkt sich das bei Hämoglobin aus. Hämoglobin besteht aus einem Protein-Anteil (Globin) mit vier Untereinheiten. Jede Untereinheit hat eine Häm-Gruppe gebunden. Die Häm-Gruppe besteht aus einem Porphyrin-Ring, der zentral ein zweiwertiges Eisen gebunden hat. An dieses Eisen wird Sauerstoff reversibel angelagert. In Abhängigkeit vom Partialdruckunterschied und von Co-Faktoren kann der Sauerstoff im Gewebe abgegeben werden.

Typisch für die Sauerstoffbindung durch Hämoglobin ist der kooperative Effekt, wodurch die Anlagerung von Sauerstoff an das erste Häm die Bindung von weiteren Molekülen an die anderen Häm-Gruppen erleichtert. Aus diesem Grund verläuft die Sauerstoff-Bindungskurve von Hämoglobin sigmoidal. Diese Kurve kann durch Co-Faktoren wie Protonen, Bisphosphoglycerat (BPG) und CO2 nach links bzw. rechts verschoben werden. Eine Linksverschiebung bedeutet, dass Sauerstoff leichter an Hämoglobin bindet (die Affinität erhöht wird). In der Folge ist die Abgabe im peripheren Gewebe reduziert. Bei einer Rechtsverschiebung reduziert sich die Sauerstoffaffinität und Sauerstoff wird leichter im Gewebe abgegeben. Dafür ist aber die Sauerstoffaufnahme reduziert. CO bindet in Hämoglobin an die gleiche Bindungsstelle wie Sauerstoff. Da die Affinität des Hämoglobins für CO ca. 200 × höher ist als für O2, wird O2 von den Bindungsstellen verdrängt. In der Folge sinkt die Sauerstoff-Verfügbarkeit im Gewebe. Außerdem wird die Sauerstoff-Bindungskurve nach links verschoben, sodass die Abgabe von Sauerstoff im Gewebe vermindert wird. CO kann ebenso an Myoglobin binden, dessen monomere Proteineinheit einer Untereinheit von Hämoglobin ähnelt und auch eine Häm-Gruppe enthält.

Hämoglobin enthält als Häm-Gruppe ein Häm b (s. Abb. 2.3). Es gibt neben Häm b noch andere Häme (Häm a, Häm c etc.). Häme spielen meist bei Elektronen-Übertragungen eine Rolle. Viele Enzyme sind mit einer Häm-Gruppe ausgestattet. Auch einige Enzyme in der Atmungskette besitzen Häm als prosthetische Gruppe. Dazu gehört auch die Cytochrom-c-Oxidase, welche Bestandteil des Komplex IV der Atmungskette ist. In diesem Fall handelt es sich um Häm a. Am Komplex IV werden Elektronen auf den Sauerstoff übertragen, der an der Oxidase gebunden ist. Dabei entsteht zusammen mit Protonen aus dem Intermembranraum der Mitochondrien Wasser. CO kann sich auch hier an das Häm anlagern und Sauerstoff verdrängen. Es lassen sich aber keine Elektronen darauf übertragen, daher kommt es zum Stopp der ATP-Synthese. Andere Enzyme, die auch eine Häm-Gruppe enthalten, sind: Katalasen, Cytochrom-c-Reduktase und Cytochrom P450. Letzteres ist essenziell für die Bildung von Steroidhormonen.

Abb. 2.3 Prosthetische Häm-Gruppe. (A) Häm A und (B) Häm B sind strukturell sehr ähnlich aufgebaut. Über das zentrale Eisen-Atom kann Sauerstoff angelagert und auf andere Moleküle übertragen werden oder als Elektronen-Akzeptor dienen.

4 Berechnen Sie das Potenzial über der inneren Mitochondrienmembran mit folgenden Annahmen: pH Intermembranraum = 6,2, pH Mitochondrienmatrix = 7,6, der Umrechnungsfaktor für RT/zF und die Umwandlung des natürlichen in den dekadischen Logarithmus ist 61 mV.

pH ist der negative dekadische Logarithmus der Protonenkonzentration. Damit wird aus der Nernstschen Gleichung

5 Warum ist der Katabolismus der Fettsäuren strikt aerob?

Der Abbau der Fettsäuren erfolgt in der β-Oxidation. Dabei entstehen neben Acetyl-CoA auch die Reduktionsäquivalente NADH/H+ und FADH2. Wie jede chemische Reaktion verlaufen auch die Redox-Reaktionen der β-Oxidation nur so lange, bis sich ein Gleichgewicht einstellt. Für biologische Reaktionen heißt das, dass diese Reaktionen nur dann dauerhaft ablaufen, wenn entweder die Edukte unbegrenzt nachgeliefert werden oder wenn die Konzentration der Produkte durch nachfolgende Reaktionen gering gehalten wird. Acetyl-CoA wird im Citratzyklus zu CO2 aufoxidiert. Dabei entstehen weitere Reduktionsäquivalente in Form von NADH/H+ und FADH2. Diese Reaktionsprodukte der β-Oxidation und des Citratzyklus (NADH/H+ und FADH2) werden in der Atmungskette verbraucht. Finaler Elektronenakzeptor ist dabei molekularer Sauerstoff. Ohne molekularen Sauerstoff akkumulieren demnach die Reduktionsäquivalente, und die entsprechenden Reaktionen kommen zum Erliegen. Der Katabolismus der Fettsäuren ist also strikt aerob, weil die Reaktionsprodukte des Fettsäureabbaus nur unter Sauerstoffverbrauch weiterverarbeitet werden können.

6 Die Energie der Nährstoffe „Kohlenhydrate“ und „Fette“ wird auf dem Weg zur ATP-Gewinnung zwischenzeitlich in den Reduktionsäquivalenten NADH/H+ und FADH2 gespeichert. Bei welchen Redox-Reaktionen in der Glykolyse, der β-Oxidation und dem Citratzyklus entstehen diese Reduktionsäquivalente?

NADH/H+ und FADH2 sind die Elektronenakzeptoren bei der Oxidation organischer Moleküle. Im Zuge dieser Redox-Reaktionen werden Aliphate erst zu Alkoholen, dann zu Aldehyden/Ketonen und schließlich zu CO2 aufoxidiert.

Dabei verläuft die Oxidation zum Alkohol meist in zwei Schritten: Erst werden in einer durch eine Dehydrogenase katalysierten Redox-Reaktion die Elektronen auf die Reduktionsäquivalente übertragen, wobei im Substrat eine C=C-Doppelbindung entsteht. Diese Doppelbindung wird anschließend durch Anlagerung von Wasser zum Alkohol. Die Oxidation der Ketogruppe verläuft meist in einer als oxidative Decarboxylierung bezeichneten Reaktion, also dass im Zuge dieser Redox-Reaktion CO2 abgespalten wird.

In der Glykolyse entsteht NADH/H+ bei der Oxidation des Aldehyds Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP) zur Säure 1-3-Bisphosphoglycerat (BPG).

Vor dem Eintritt in den Citratzyklus wird Pyruvat oxidativ decarboxyliert. Chemisch ist das nichts anderes als die Oxidation eines Ketons zur Carbonsäure bzw. hier zu CO2. Die Elektronen werden ebenfalls von NAD+ aufgenommen, und es entsteht NADH/H+.

Im Citratzyklus wird Essigsäure zu zwei CO2 aufoxidiert. Damit gibt es vier Redox-Reaktionen, bei denen Elektronen auf die Reduktionsäquivalente übertragen werden können, nämlich zwei oxidative Decarboxylierungen, eine Oxidation zum Alkohol und eine Oxidation zum Aldehyd/Keton. Genau diese Redox-Reaktionen werden im Citratzyklus auch genutzt (s. Abb. 2.4).

Abb. 2.4 Citratzyklus: Die Acetyl-Gruppe aus Acetyl-CoA wird auf Oxalacetat übertragen, und es entsteht Citrat. Nach einer Umwandlung in Isocitrat folgen zwei oxidative Decarboxylierungen, und es entsteht Succinyl-CoA. Nach der Abspaltung von Coenzym A wird Succinat in drei Schritten zu Oxalacetat aufoxidiert. Die Elektronen, die das Acetat in den Kreislauf einbringt, werden auf Reduktionsäquivalente (NADH/H+ und FADH2) übertragen, und die Kohlenstoffe werden zu CO2 aufoxidiert Die Elektronen der Reduktionsäquivalente NADH/H+ werden über die NADH-Dehydrogenase in Komplex I in die Atmungskette eingeschleust.

Nach der Übertragung der Acetyl-Gruppe von Acetyl-CoA (aktivierte Essigsäure) auf Oxalacetat und der Umwandlung von Citrat in Isocitrat erfolgt die erste oxidative Decarboxylierung. Unter Abspaltung von CO2 entsteht α-Ketoglutarat. Dieses α-Ketoglutarat wird auch oxidativ decarboxyliert, und es entsteht unter Abspaltung von CO2 erst Succinyl-CoA, dann Succinat. Bei beiden oxidativen Decarboxylierungen werden die Elektronen auf NAD+ übertragen, und es entsteht NADH/H+.

Jetzt folgt die Oxidationsreihe einer C-C-Bindung (Aliphat) über einen Alkohol (C-OH) zum Keton (C=O). Wie oben erwähnt, verläuft die Oxidation zum Alkohol in zwei Schritten. Erst wird bei der Redox-Reaktion in Succinat eine Doppelbindung eingefügt, und es entsteht Fumarat. Die Elektronen werden bei dieser Reaktion auf FAD übertragen, und es entsteht FADH2. An Fumarat wird Wasser angelagert, und es entsteht Malat. Die alkoholische Gruppe in Malat wird dann aufoxidiert zur Ketogruppe, und es entsteht Oxalacetat. Auch bei dieser Redox-Reaktion wird NAD+ zu NADH/H+ reduziert.

Bei der β-Oxidation wird die C-C-Bindung bis zur Ketogruppe aufoxidiert, bevor ein C2-Körper (Essigsäure) auf das Coenzym A übertragen und als Acetyl-CoA in den Citratzyklus eingeschleust wird. Die Redox-Reaktionen sind dabei ähnlich den Redox-Reaktionen im Ci­tratzyklus bei der Oxidation von Succinat zu Oxalacetat. Auch hier wird erst eine Doppelbindung eingefügt und dann Wasser angelagert. Entsprechend entsteht aus Acyl-CoA erst 2-Enoyl-CoA, das dann zu 3-Hydoxy-Acyl-CoA hydriert wird.

Die Elektronen werden bei dieser Reaktion auf FAD übertragen, und es entsteht FADH2. Die alkoholische Gruppe im 3-Hydoxy-Acyl-CoA wird dann aufoxidiert zur Ketogruppe in β-Keto-Acyl-CoA. Bei dieser Redox-Reaktion wird NAD+ zu NADH/H+ reduziert.

Einen Vergleich der drei Stoffwechselvorgänge zeigt Tabelle 2.1.

Tab. 2.1 Vergleich von Glykolyse, β-Oxidation und Citratzyklus
	Glykolyse	β-Oxidaton	Citratzyklus
NADH/H+	Glycerinaldehyd-3-P → 1,3-BisphosphoglyceratPyruvat → Acetyl-CoA	3-Hydoxy-Acyl-CoA →β-Keto-Acyl-CoA	Isocitrat → α-Ketoglutaratα-Ketoglutarat → Succinyl-CoAMalat → Oxalacetat
FADH2		Acyl-CoA → 2-Enoyl-CoA	Succinat → Fumarat
ATP	1,3-Bisphosphoglycerat → 3-PhosphoglyceratPyruvat → Acetyl-CoAPhosphoenolypyruvat → Pyruvat
GTP			Succinyl-CoA → Succinat
CO2	Pyruvat → Acetyl-CoA		Isocitrat → α-Ketoglutaratα-Ketoglutarat → Succinyl-CoA

7 Wie nutzt die ATP-Synthase den Protonengradienten zur Neusynthese von ATP?

Die ATP-Synthase ist ein membranständiger Protonenkanal, der in der inneren Membran der Mitochondrien lokalisiert ist. Darüber hinaus besitzt die ATP-Synthase eine katalytische Einheit, die auf der Mitochondrienmatrix-Seite die Neusynthese von ATP katalysiert. In der Atmungskette wird durch die Translokation der Protonen aus der Mitochondrienmatrix in den Intermembranraum ein chemiosmotisches Potenzial aufgebaut. Der einzig gangbare Weg, diesen Protonengradienten zu egalisieren ist, dass die Protonen durch die ATP-Synthase hindurch in die Mitochondrienmatrix diffundieren. Die ATP-Synthase speichert die Energie, die beim Durchtritt der Protonen frei wird in einer energiereichen Phosphat-Phosphat-Bindung. Der Wirkungsmechanismus dabei ist, dass die diffundierenden Protonen eine Rotation der katalytischen Untereinheit antreiben (s. Abb. 2.5). Dabei gilt, dass jedes Proton eine Drehung um 120° induziert, für eine vollständige Drehung des Enzyms also die Diffusion von drei Protonen erforderlich ist. Demnach liefert die Translokation von drei Protonen ein ATP.

Abb. 2.5 Der Protonendurchtritt induziert eine Rotationsbewegung der zentralen Einheit der ATP-Synthase. Dies induziert Konformationsänderungen im Gesamtprotein, die zur Synthese von ATP genutzt werden.

Die Drehung der ATP-Synthase ist nichts anderes als sich wiederholende Konformationsänderungen des Proteins, die im Wesentlichen darauf beruhen, dass die Protonen mit sauren Resten (Aspartat) des Kanalproteins wechselwirken. Diese induzierten Konformationsän­derungen im Kanal verursachen Konformationsänderungen in der katalytischen Untereinheit. Damit ändern sich in der katalytischen Un­tereinheit die Affinitäten zu ATP, ADP und Phosphat in einer fein abgestimmten Weise, sodass mit einer vollständigen Rotation netto aus ADP und Phosphat ATP synthetisiert wird.

8 Was ist der Unterschied zwischen der ATP-Synthase und einer Protonenpumpe?

Die ATP-Synthase kann prinzipiell auch als Protonenpumpe fungieren und dabei ATP verbrauchen. Diese „Rück“-Reaktion spielt in Mitochondrien allerdings kaum eine Rolle. Während die ATP-Synthase für jedes neu-synthetisierte ATP den Fluss von drei bis vier Protonen benötigt, pumpt eine richtige Protonenpumpe nur zwei Protonen pro ATP-Hy­drolyse. Anders ausgedrückt, die Energie, die in einer Phosphodiester-Bindung des ATP steckt, entspricht bei der ATP-Synthase der Energie von drei bis vier ungleich verteilten Protonen. Bei der Protonenpumpe entspricht diese Energie nur der von zwei ungleich verteilten Protonen. Entsprechend ist für die ATP-Synthase ein relativ geringer Protonengradient hinreichend, um die Energie für die Neusynthese von ATP zu liefern, oder anders ausgedrückt, in der Rückreaktion kann die ATP-Synthase als Protonenpumpe nur einen geringen pH-Gradienten generieren.

Der prinzipielle Mechanismus der durch ATP-Synthase und Protonenpumpe katalysierten Reaktion ist also gleich, der Unterschied liegt letztendlich in der Anzahl an Protonen, die eine vollständige Rotation des Enzyms bewirken.