Kitabı oku: «Нестандартные подходы к лечению желчнокаменной болезни», sayfa 3
В России первый отечественный литолитический препарат – октаглин, синтезированный в институте органической химии АН СССР имени Н.Д. Зелинского старшим научным сотрудником, доктором химических наук Э.И. Троянским по рекомендации профессора П.М. Постолова (Постолов П.М. с соавт., 1988). Октаглин – это монооктаноин и представляет из себя продукт этерификации глицерина октановой кислотой. Он является раствором монооктаноата глицерина в смеси ди– и триоктаноата глицерина в определенных соотношениях, что определяет его физические свойства. Выгодное отличие октаглина в этом плане от американского аналога, коммерческого препарата Campul-8210, состоит в том, что обладая низкой вязкостью, сохраняющейся при комнатной температуре и температуре тела, он может свободно вводиться в желчевыводящие пути без постоянного подогрева, что не требует особого оборудования и значительно упрощает процедуру контактного растворения с помощью данного препарата. В.Ю. Новокщеновым была изучена в стендовых опытах специфическая (литолитическая) активность октаглина (Новокщенов В.Ю., 1989). Выявлено довольно выраженное литолитическое действие на холестериновые камни. Чрезвычайно важным с клинической точки зрения является факт растворения через четверо суток смешанных по химическому составу конкрементов, где примесь кальция и пигмента составили около 20%. Изучалось также действие октаглина на кальцинированные камни. Через трое суток потеря массы камней составляла 58%, однако в дальнейшем она не менялась, а оставшиеся фрагменты представляли собой коралловидные образования каменистой плотности, но довольно хрупкие, размерами от 5 до 6мм. Помимо специфической активности октаглина были изучены его острая и хроническая токсичность, тератогенность, алергизирующие свойства. Результаты этих исследований убедительно свидетельствовали о безвредности октаглина и возможности его применения в клинических условиях. Вместе с тем, при использовании октаглина для литолиза конкрементов желчевыводящих путей наблюдались боли в животе, тошнота, рвота, диарея, лихорадка (Быков А.В. с соавт., 1991).
Контактный химичекий литолиз применяется с 1985 года в таких странах, как Германия (Helmstadter A., 1999), Италия (Tritapepe R.A., 1998), США (Kelly E.A., et. al., 2000), Швейцария (Hetzer F.H., et. al., 2001), Англия, Тайвань, Камерун (Африка) (Jarrett L.N., et. al., 1981). Растворению подвергаются рентгеннегативные (холестериновые) желчные камни изо– или гиподенситометрической плотности (менее 10ЕД по Хаунсфилду), независимо от их количества и размеров. Эффективность KXJI составляет 90-95%. В России, к большому сожалению, широко данный метод не используется (Тюрюмин Я.Л., 2000).
Высокая токсичность и низкая эффективность используемых для литолиза препаратов, длительность и трудоемкость лечения, высокий процент ранних рецидивов, необходимость длительного проведения противорецидивной терапии, способствовали отказу хирургов от использования этих методов лечения (Григорьева И.Н., 2001; Бородач В.А. с соавт., 2013).
Резюмируя все вышесказанное, представляется перспективным поиск новых патогенетически обоснованных методов литолиза, использование которых, позволит повысить эффективность лечения холелитиаза и сократить сроки реабилитации данных пациентов.
3.2. Оптимизация литолитической смеси для растворения желчных камней
Для выполнения поставленной задачи необходимо было найти реагент, который хорошо растворяет холестериновые и пигментные конкременты, обладает низкой токсичностью и производится фармацевтической промышленностью.
В ходе экспериментального поиска были использованы достаточно известные, ранее испытанные растворители желчных камней: глицерин (n=149), октанол (n=35), этилпропионат (n=30), метил-трет-бутиловый эфир (n=30), хенодезоксихолевая кислота (n=10), урсодезоксихолевая кислота (n=10), цитрат натрия (n=12), трилон Б (n=15) и гепарин (n=12). Учитывая данные литературы [157], нам представлялось перспективным использование для химического литолиза конкрементов желчевыводящих путей, слабых карбоновых кислот, а именно, как наименее токсичной из них, окта́новой кислоты (n=297). Ниже приведены свойства указанных соединений.
Октановая кислота 99,0% («ACROS ORGANICS», Нью-Джерси, США) – н-октановая кислота, каприловая кислота, Международное название: Octanoic acid) С7Н15COOH – одноосновная предельная карбоновая кислота (насыщенная жирная кислота), бесцветная маслянистая жидкость с неприятным запахом. Регистрационный номер CAS 124-07-2. SMILES – CCCCCCCC(=O)O. Образуется при сухой перегонке олеиновой кислоты и при окислении нормального октилового спирта. Молярная масса 144,21 г/моль. Кристаллизуется на холоде, tпл. 16,5 °C, tкип. 237,5 °C. Плотность 0,91г/см3, (20°/4°), nD20 = 1,4285. Диэлектрическая проницаемость: 2.45 при 20°С. Показатель преломления: 1.4279 при 20°С. Растворяется в спирте, эфире и в горячей воде (Курц А.Л., Реутов О.А., 2010). Вязкость октановой кислоты при 20º – 5,83 сантипуаз (мПа•с) (Иванов А.В., 2002).
Глицерин 99,3% C3H5(OH)3 (Черкасский завод химреактивов, ГОСТ 6259-75, Россия) – бесцветная, вязкая жидкость, простейший трехатомный спирт. Плотность при 20º – 1,261-1,261 г/см³. Температура плавления – 20°C, температура кипения – 290°C. Удельный вес глицерина = 1,2590 – 1,2637. Глицерин оптически недеятелен; показатель преломления для линии β водорода равен 1,478-1,4744 [119]. Вязкость глицерина при 20º – 1480 сантипуаз (мПа•с) (Тиноко И. с соавт., 2005).
Октанол 98,0% («ACROS ORGANICS», Нью-Джерси, США) – 1-Octanol C8H18O, 98%, MW (молярная масса) = 130,23 г/моль, d (плотность) = 0,824 г/см3, bp (температура кипения)=195°C.
Метил-трет-бутиловый эфир ˃99,0% (SUPELCO, Sigma-Aldrich Corporation, США) – трет-бутилметиловый эфир, 2-метил-2-метоксипропан (МТБЭ) – химическое вещество с химической формулой СН3-O-C(СН3)3. Плотность при 20ºС – 0,7405. Коэффициент преломления при 20ºС – 1,3690. Удельная теплоемкость – 2,1кДж/кг•К. Теплота парообразования – 332,5кДж/кг. Растворим в этаноле, диэтиловом эфире, плохо – в воде (4,6 % при 20ºС). Образует азеотропные смеси: с метанолом (МТБЭ – 85 % мас.), температура кипения – 52ºС; с водой (МТБЭ – 96 % мас.), температура кипения – 52,6оС.
Этилпропионат ˃99,7% («Sigma-Aldrich», Германия) – этиловый эфир пропионовой кислоты – CH3CH2COOC2H5, tпл -73,9°C, tкип 99,1°C; d425 0,885; растворяется в воде (2,5% при 15°C), органических растворителях; tвсп 12°C, tвосп 445°C. Lot&Filling code:1337320 32607212 Mr 102.14 [104-37-3], puriss. p.a.; ≥ 99,7% (GC).
Хенодезоксихолевая кислота ˃98,0% («Fluka Biochemika», «Sigma-Aldrich», Италия) – сhenodeoxycholic acid, 3α, 7α-Dihydroxy-5β-cholanic acid, Lot&Filling code: 409001/1 42307414 Assay≥98,0% (T), C24H40O4 Mr 392.58.
Урсодезоксихолевая кислота ˃99,0% («Fluka Biochemika», «Sigma-Aldrich», Италия) – ursodeoxycholic acid, Lot&Filling code: 1217010 107707089 C24H40O4 Mr 392.58 [128-13-2]. ≥99% (T).
Цитрат натрия 95,0% («Полисинтез», Россия) – натриевая соль лимонной кислоты Na3C6H5O7.
Трилон Б («Лабораторная техника», ГОСТ 10652-73, Россия) – динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (комплексон-III, трилон Б, хелатон III, ЭДТА – C10H14O8N2Na2*2H2O) – белый кристаллический порошок или кристаллы белого цвета, хорошо растворимые в воде и щелочах, очень малорастворимые в спирте; растворимость в воде при температуре 20°C составляет 100г/л, при температуре 80°C – 230 г/л. ж; рН 1%-ного водного раствора 4,5; рН препарата с массовой долей 5% 4-5.5. Молекулярная масса: 336,21. (Курц А.Л., Реутов О.А., 2010).
Гепарин (ФГУП «Московский эндокринный завод», Россия) – гепарин натрия, антикоагулянт прямого действия, раствор для внутривенного и подкожного введения.
В экспериментах in vitro по контактному растворению было использовано 297 конкрементов, извлеченных у пациентов, оперированных по поводу желчнокаменной болезни. Из них низкоминерализованных – 123, среднеминерализованных – 89, высокоминерализованных – 85.
Начиная с конкрементов низкой минерализации и предварительно взвешивая каждый камень (m1, мг), мы помещали их в пробирки и заливали соответствующим реактивом. При этом в течение нескольких часов поддерживалась постоянная температура, равная температуре тела человека при помощи термостата ТС-1/20 СПУ. По истечении определенного времени (t, мин) эксперимент прерывался, остатки конкремента извлекались из реактива, высушивались и повторно взвешивались (m2, мг). Для более удобной оценки результатов нами был введен условный коэффициент (К), отражающий время растворения конкремента в мин в пересчете на 1 мг массы камня. К высчитывался по следующей формуле K=t/m2-m1.
В опытах с использованием хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, Трилона Б, цитрата натрия, гепарина эффекта достигнуто не было, масса конкрементов осталась прежней даже при достаточно длительной экспозиции конкремента в соответствующем реактиве в течение суток при температуре тела человека, независимо от степени минерализации. Наибольшая литолитическая активность обнаружена у октановой кислоты. У октанола она была на 44,1% ниже по сравнению с его кислотным аналогом.
Преимущества октановой кислоты более проявляются при растворении конкрементов высокой минерализации. Так литолитическая активность метил-трет-бутилового эфира ниже октановой кислоты на 20,0% (р<0,001), этилпропионата на 5,4% (р<0,001) при воздействии на камни с большим содержанием кальция. Растворяющая способность октанола в зависимости от минерализации конкрементов ниже по сравнению с октановой кислотой на 64,1% (р<0,001), 31,5% (р<0,001) и 38,5% (р<0,001) соответственно при литолизе камней низкой, средней и высокой минерализации.
При этом растворимость конкрементов обратно пропорциональна степени их минерализации: чем ниже содержание кальция, тем быстрее происходил лизис камня.
При использовании октановой кислоты литолитическая активность в отношении среднеминерализованных конкрементов ниже по сравнению с группой низкой минерализации на 33,4% (р=0,001). В отношении высокоминерализованных на 52,3% (р<0,001), в сравнении с камнями низкой минерализации и на 14,1% (р=0,033) относительно группы средней минерализации. При проведении корреляционного анализа обнаружена прямая зависимость между содержанием кальция в камне и временем его растворения.
Также при использовании октановой кислоты обнаружены прямые, но менее сильные корреляционные зависимости времени литолиза от содержания хрома, фосфора, ванадия, лития, алюминия, магния, железа, калия, натрия, кремния, титана. При лизисе конкрементов высокой минерализации при помощи октанола время литолиза выше на 28,5% (р=0,041) в сравнении с камнями низкой минерализации и на 20,2% (р=0,033) относительно камней средней минерализации. Эта зависимость подтверждается корреляционным анализом между содержанием кальция и временем литолиза.
Кроме того, при использовании октанола растворимость камней напрямую зависела от содержания хрома, фосфора, алюминия, магния, калия, натрия. Выявлена также обратная зависимость от содержания в сухом остатке камня никеля и стронция.
Активность метил-трет-бутилового эфира также снижается при воздействии на конкременты средней минерализации на 23,9% (р=0,034) в сравнении с группой камней низкой минерализации и на 90,5% (р<0,001) при воздействии на камни высокой минерализации. При этом растворимость конкрементов с высоким содержанием кальция ниже на 53,7% (р=0,003) по сравнению с группой конкрементов со средним содержанием кальция. При проведении корреляционного анализа также выявлена прямая сильная связь растворимости камней с концентрацией кальция (rs=0,82; р<0,05), что говорит о большей зависимости растворимости камней от этого элемента по сравнению с октановой кислотой (rs=0,59; р<0,05). Также прямые зависимости при использовании МТБЭ регистрируются со значениями хрома, фосфора, ванадия, лития, алюминия, магния, железа, калия, натрия, кремния.
При использовании этилпропионата литолитическая активность снижается на 41,8% (р<0,001) и на 63,6% (р<0,001) при воздействии на средне и высокоминерализованные камни соответственно по сравнению с группой камней низкой минерализации. Высокоминерализованные растворяются медленнее среднеминерализованных на 15,4% (р=0,037), что подтверждается сильной корреляционной зависимостью между содержанием кальция и временем лизиса (табл. 6) Прямые корреляционные взаимоотношения при использовании этилпропионата выявлены также между растворимостью камней и концентрацией хрома, фосфора, ванадия, алюминия, магния, железа, калия, натрия, кремния. Обратная слабая связь обнаружена только с содержанием бария.
Таким образом, приведенные выше результаты свидетельствуют о большей литолитической активности октановой кислоты в отношении желчных камней по сравнению с известными ранее растворителями. В основном это преимущество достигается за счет активности в отношении конкрементов с высоким содержанием кальция, тогда как метил-трет-бутиловый эфир и этилпропионат намного менее активен в отношении этих камней. Скорость литолиза напрямую зависит от состава конкрементов, что видно на примере всех использованных растворителей: чем ниже содержание кальция в камнях, тем быстрее идет процесс растворения. Зависимость от содержания других минералов минимальна, о чем говорят слабые корреляционные связи между их содержанием и временем растворения.
На следующем этапе для подбора оптимального состава литолитической смеси был проведен ряд экспериментов in vitro.
В связи с тем, что октановая кислота имеет вязкость при 20ºС – 5,83 сантипуаз (мПа•с) (Иванов А.В., 2002), при температуре тела человека, соответственно еще меньше, то при использовании in vivo данный растворитель будет достаточно быстро эвакуироваться из желчевыводящих путей в просвет двенадцатиперстной кишки. Данное обстоятельство снижает время контакта растворителя с конкрементом и, следовательно, его растворимость, что потребует дополнительного введения октановой кислоты и повысит общую токсичность лечения. Наряду с этим, часть эвакуированного растворителя в просвете кишечника будет адсорбироваться в общий кровоток, что также приведет к повышению токсичности. В связи с этим, необходимо в состав литолитической смеси включить реагент, обладающий достаточной вязкостью, что позволит удерживать более длительную экспозицию растворителя в просвете желчевыводящих путей. При этом реагент должен обладать малой токсичностью и вызывать минимальные побочные эффекты. В качестве подобного реагента был выбран глицерин. Вязкость глицерина при 20ºС составляет 1480 сантипуаз (мПа•с) (Тиноко И. с соавт., 2005), что в 254 раза превышает вязкость октановой кислоты.
Используя различные соотношения октановой кислоты и глицерина, конкремент заливался соответствующей смесью и в течение нескольких часов, при температуре тела человека, оценивалась эффективность используемой смеси.
На основании многочисленных экспериментов было найдено оптимальное соотношение «октановая кислота : глицерин» – 1:1, в данной пропорции скорость растворения конкрементов осталась практически прежней. При увеличении доли глицерина литолитический эффект не наступает (табл. 7). Статистически значимых отличий по литолитической активности между чистой октановой кислотой и разведении её в 1,5 и 2 раза глицерином выявлено не было.
Уменьшение токсичности октановой кислоты при смешивании её с глицерином обусловлено образованием значительного количества водородных связей, возникающих между ОН-группой кислоты и кислородом одного из гидроксилов глицерина, а также между ОН-группой глицерина и кислородом карбоксильной группы кислоты. Эти взаимодействия снижают реакционную способность октаноата и, следовательно, его токсичность (Курц А.Л., Реутов О.А., 2010). Кроме того, уменьшается количество октановой кислоты, требуемой для растворения конкремента, что также снижает общую токсичность лечения.
На следующем этапе in vitro были проведены эксперименты по изучению литолитической активности предлагаемой смеси в зависимости от степени минерализации конкрементов. Установлено, что время растворения конкрементов зависело от степени минерализации камней, как и при использовании октановой кислоты.
Так, при растворении конкрементов средней минерализации время воздействия возросло на 28,0% (р<0,001) по сравнению с низкой минерализацией, при лизисе камней высокой минерализации на 52,9% (р<0,001) и в отношении группы камней средней минерализации на 19,4% ((р=0,037), что подтверждается прямой зависимостью между временем растворения и содержанием кальция в камнях (rs=0,65, р<0,05).
Также были зарегистрированы положительные корреляции времени растворения камня с использованием литолитической смеси и содержанием в сухом остатке конкремента свинца (rs=0,21, р<0,05), ванадия (rs=0,42, р<0,05), магния (rs=0,44, р<0,05), и обратная зависимость слабой силы от содержания никеля (rs=-0,26, р<0,05).
При сравнении литолитической активности предлагаемой смеси с другими реагентами получены
Статистически значимые отличия по литолитической активности предлагаемой смеси выявлены с октанолом: последний на 39,3% (р<0,001) слабее камнерастворяющей смеси «октановая кислота : глицерин».
Наряду с этим, в случае конкрементов высокой минерализации имеется тенденция к сокращению времени литолиза при использовании камнерастворяющей смеси «октановая кислота : глицерин» (6,97±2.36, n=17), по сравнению с этилпропионатом (7,06±2,13, n=10) и метил-трет-бутиловым эфиром (8,04±2,95, n=11).
Таким образом, использование литолитической смеси «октановая кислота : глицерин» в соотношении 1:1 позволит увеличить вязкость раствора и соответственно время воздействия растворителя на конкремент без снижения растворяющей способности основного реагента.
3.3. Апробация литолитической смеси при экспериментальном холелитиазе
В эксперименте in vivo использовано 40 половозрелых кроликов – самцов, весом 2,8-3,4 кг. Под наркозом (ксилазин 0,05мл/кг внутримышечно + золетил 1,5мг/кг внутримышечно) с добавлением местной анестезии (0,25% – 40,0 новокаина) выполнялась минилапаротомия в проекции дна желчного пузыря 3,0-4,0см. Вскрывался желчный пузырь, подсаживался конкремент, извлеченный из желчного пузыря пациентов, оперированных по поводу желчнокаменной болезни, после чего накладывалась холецистостома при помощи подключичного катетера. Лапаротомная рана ушивалась послойно, наглухо. Кролики разбиты на группы по характеру подсаженных конкрементов: в 9-ти случаях подсажены низкоминерализованные конкременты, в 10-ти средней минерализации и 16 кроликам высокоминерализованные.
Для контроля №1 было использовано 5 кроликов с подсаживанием конкрементов в просвет желчного пузыря, без наложения холецистостомы и соответственно без введения растворителя.
Вторая группа контроля: 5 кроликов – животные с наложенной холецистостомой, без подсадки конкремента.
Во время операции всем кроликам производился забор крови из яремной вены для биохимического исследования. В крови исследовалось содержание билирубина, активность аланинаминотрансферазы (АлАт), аспартатаминотрансферазы (АсАт) и амилазы, концентрация мочевины, креатинина по стандартным общепринятым методикам (Кишкун А.А., 2007). В послеоперационном периоде проводилась инфузионная терапия однократно солевыми растворами в объеме 120,0мл, профилактика инфекционных осложнений с помощью антибиотиков и введение обезболивающих препаратов. На третьи сутки после операции через холецистостому начинали вводить литолитическую смесь, состоящую из октановой кислоты с глицерином в соотношении 1:1 в объеме 0,5-0,6мл 1 раз в день, из расчета 0,2мл/кг массы животного, что примерно соответствует объему желчного пузыря кролика, после чего дренаж пережимали. Обоснование введения именно данной смеси представлено в разделе 3.2. В начале экспериментальных исседований введение продолжали до 5 дней, после чего кроликов забивали, производилось вскрытие грудной и брюшной полостей с морфологическим исследованием органов и тканей. Эвтаназия производилось внутривенным введением токсической дозы тиопентала натрия.
В связи с тем, что на 5 сутки происходило полное растворение камней, постепенно уменьшали количество дней введения до 2. Кроликам контрольной группы №2 литолитическую смесь вводили в течение 3 – 4 дней. Кроликов выводили из эксперимента на 3-и (n=12), 5-е (n=10), 7-е (n=9), 14-е (n=9) сутки после прекращения введения литолитической смеси.
Для гистологического исследования забирали стенку желчного пузыря, тонкой кишки, ткань печени, почек, а также забирали кровь для контрольного биохимического анализа. Из фрагментов паренхиматозных органов вырезались фрагменты не менее 1,0х1,0х0,5см, из полых органов – вырезали кусочки на всю толщину стенки органа. Вырезанный материал фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина в течение 24-х часов, а после подвергали – парафиновой инфильтрации по общепринятой методике. Отобранные фрагменты ткани размером 1,0х1,0х0,5-1,5х1,5х0,5 см подвергались процедуре фиксации в растворе 10%-ного нейтрального формалина в течение 24-х часов, при комнатной температуре. Соотношение фиксируемого материала и фиксирующей жидкости – не менее чем 1:10 – 1:15. После фиксации материал промывался в течение 1,5 часов в проточной воде. В дальнейшем достигалось обезвоживание тканей путем проведения ее через спирты возрастающей крепости – от 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%. Использовались растворы этилового спирта. Экспозиция в первых 5-и растворах достигала 3-х часов; в последних 2-х растворах 96% и абсолютного спирта – по 12 часов.
Обезвоженные фрагменты ткани подвергали химическому уплотнению путем инфильтрации и заливки в парафин. Для этого была использована готовая гистологическая среда для заливки Histomix (гистомикс; Биовитрум, Россия) с точкой плавления до 54°С. Фрагменты из абсолютного спирта переносились в три смеси абсолютного спирта с хлороформом в равных соотношениях, сроком на 1 час в каждую. Затем переносились в расплавленный насыщенный раствор гистомикса в хлороформе (массовое соотношение смеси 1:1), где они находились в термостате при температуре 37ºС до 1 суток. Последующая заливка проводилась в термостате при температуре 56º – 58ºС в трех порциях гистологической среды, экспозицией 1, 2 и 3 часа соответственно. Окончательные гистологические блоки формировались с помощью гистологических форм и полимерных кассет-оснований.
Срезы с полученных блоков толщиной 4-5мкм изготовлялись на ручном микротоме санного типа МС-2 с помощью одноразовых микротомных ножей Feather R35 (Япония), имеющих угол заточки 35С°.
Обзорные препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, использовали для общей оценки состояния исследуемых тканей, пикрофуксином по Ван Гизону (для селективной окраски соединительной ткани) и альциановым синим (рН 2,5) с постановкой ШИК-реакции (для выявления кислых и нейтральных мукополисахаридов и углеводов в тканевых образцах).
Средняя масса подсаженных конкрементов составила 47,29±14,3мг (20 – 69мг). В группе с подсадкой низкоминерализованных камней 36,11±15,7мг (20 – 60мг), в группе с конкрементами средней минерализации 53,60±9,8мг (33 – 69мг) в группе с камнями высокой минерализации 49,63±12,1мг (29 – 68мг).
После начала введения литолитической смеси не отмечено каких-либо изменений в характере поведения кроликов (агрессивность, вялость и др.) и общем состоянии (внешний вид, состояние шерсти, вес, аппетит).
В результате экспериментов – в основной группе 1 летальный исход на этапе освоения методики: смерть наступила от разлитого желчного перитонита из-за несостоятельности холецистостомы на пятые сутки после операции. Кролику в данном случае был подсажен среднеминерализованный конкремент массой 54мг. При аутопсии обнаружено подтекание желчи из желчного пузыря из точечного отверстия в месте стояния холецистостомы, в просвете пузыря обнаружены остатки конкремента массой 2мг. Летальность в основной группе составила 2,86%.
Низкоминерализованные конкременты растворились во всех случаях введения раствора октановой кислоты в глицерине, среднеминерализованные при введении в течение 3 дней и более, высокоминерализованные на 4– сутки лечения. Эффективность контактной литолитической терапии показана в таблице 10.
Неполное растворение наблюдалось при использовании среднеминерализованных конкрементов в 2-х случаях после 2-х кратного введения препарата. Исходная масса камней при этом была достаточно высокой: 54 и 69мг, после эксперимента 2 и 3мг соответственно, то есть снижение массы происходило на 95-97% от исходной.
При использовании камней высокой минерализации неполное растворение наблюдалось дважды при трёхкратном введении литолитической смеси и дважды при двукратном введении. При этом исходная масса конкрементов при трёхкратном введении составляла 58 и 63мг до, и 8 и 4мг после эксперимента соответственно, масса камней снизилась на 86-94%. При двукратном введении 59 и 48мг при подсадке камня, 12 и 9мг по окончанию эксперимента, снижение массы на 89-91%.
Таким образом, в результате эксперимента растворились 80% подсаженных конкрементов (снижение массы конкрементов происходило на 86-97% от исходной). Оставшиеся 20% подверглись неполному разрушению вследствие высокого содержания кальция в структуре камней, а также недостаточной экспозиции растворителя. Для полного растворения указанных конкрементов, вероятно, необходимо более длительное введение литолитической смеси, что подтверждает полная растворимость конкрементов независимо от их состава при при 4-х кратном введении литолитической смеси.
При анализе биохимических показателей на фоне введения литолитической смеси исследуемые параметры остались в пределах нормы, хотя выявлено незначительное повышение уровня билирубина на 5,7% (р=0,011), возрастание активности амилазы на 7,0% (р=0,042), скорость аспартатаминотрансферазной реакции выросла на 55,3% (р=0,037), аланинаминотрансферазной – на 12,1% (р=0,035), содержание мочевины и креатинина оставалось прежним. При этом в группе кроликов с моделированием желчнокаменной болезни без использования литолитической смеси произошли более выраженные изменения биохимических показателей на фоне наличия конкремента в желчном пузыре. Концентрация билирубина повысилась на 11,8% (р<0,001) на фоне роста активности амилазы на 74,1% (р<0,001), аспартатаминотрансферазы на 184,5% (р<0,001), аланинаминотрансферазы на 142,0% (р<0,001). Также, в отличие от основной группы, увеличились значения мочевины на 14,9% (р<0,001) и креатинина на 32,0% (р<0,001). При этом имеются отличия по показателям в конце лечения между группами по цифрам аминотрансфераз: при лечении литолитической смесью активность аспартатаминотрансферазы была ниже на 28,5% (р=0,043), чем в группе без лечения, аланинаминотрансферазы – на 17,3% (р=0,021). Кроме того, имелись различия по конечному уровню креатинина: в группе кроликов с введением камнерастворяющей смеси этот параметр был ниже на 14,6% (р1=0,039).
Вышеприведенные данные свидетельствуют о минимальном влиянии предлагаемой смеси на функцию печени, почек и поджелудочной железы. Наблюдаемые сдвиги биохимических показателей обусловлены операционной травмой, что подтверждается наличием более выраженных изменений в группе кроликов без введения литолитической смеси. Данный факт, по всей вероятности, обусловлен развитием воспалительного процесса в желчном пузыре и желчевыводящих путях на фоне подсадки конкремента.
Особый интерес представляли результаты морфологического исследования различных органов после применения литолитической смеси.
Высота эпителиальных клеток варьировала в зависимости от степени дилатации органа (от уплощенных и кубических, до высоких цилиндрических). При постановке ШИК-реакции независимо от степени растяжения стенки пузыря и уплощения эпителиальной выстилки, четко определялась узкая гликопротеиновая оболочка на поверхности слизистой и секреторно активные клетки. Количество слизьпродуцирующих клеток, по сравнению с группой контроля №1, несколько снижено. В нескольких случаях, в отечной подслизистой зоне отмечалась неравномерная, диффузно рассеянная, скудная лимфоцитарно-плазмоцитарная инфильтрация. Мышечной слой и серозная оболочка сохраняли свое обычное гистологическое строение, особенностей, по отношению к группам сравнения, не имели.
На 3-5-е сутки после выведения животного основной группы из эксперимента слизистая желчного пузыря характеризовалась уплощением рельефа, сглаженностью, но полной сохранностью на всем протяжении.
В группе контроля №1 в случае выведения животного из эксперимента на 3-и и 5-е сутки после операции характер и степень выраженности патологических изменений были схожи. При макроскопическом исследовании в подпеченочном пространстве отмечался умеренно выраженный спаечный процесс; желчный пузырь зачастую был деформирован. На 3-и сутки эксперимента в перивезикальном пространстве отмечалось наличие серозного экссудата; а в подпеченочной области отмечался отек тканей и скопление мутной желтоватой жидкости. При вскрытии пузыря, в просвете обнаруживалось до 0,3-0,5мл мутной с мелкими хлопьями желчи и ранее имплантированные конкременты. Характерной особенностью являлось адгезирование на поверхности конкрементов десквамированного эпителия и клеточного детрита, белковых фракций желчи и фибрина, что приводило к увеличению массы конкремента от исходной. Слизистая желчного пузыря, на значительном протяжении, со сглаженным рельефом, отечная, от желто-зеленого до багрово-черного цветов. В месте стояния конкремента, зачастую, формировался след-отпечаток.
При гистологическом исследовании стенки желчного пузыря и паренхимы печени в зоне ложа выявлялась уплощенная эпителиальная выстилка с дистрофическими и атрофическими изменениями. Собственная пластинка слизистой оболочки и подслизистая основа были диффузно инфильтрированы лимфогистиоцитарными элементами с примесью плазматических клеток. В зоне стояния конкремента слизистая оболочка на значительном протяжении отсутствовала (эпителиальные элементы обнаруживались в виде отдельных фрагментов среди масс детрита), а в мышечном слое органа отмечались зоны диссоциации мышечных и соединительнотканных элементов и диффузная лейкоцитарная инфильтрация. В микроциркуляторном русле выявлялся стаз, а в сосудах среднего калибра – тромбообразование, отмечались очаговые свежие кровоизлияния. Серозная оболочка утолщена за счет отека, воспалительной инфильтрации, наличия фибринозных наложений (явления перихолецистита). Паренхима печени характеризовалась гепатоцитами в состоянии зернистой дистрофии, обедненными гликогеном, со скудной очаговой инфильтрацией стромы в зоне триад.
