Kitabı oku: «Métodos analíticos de microbiología general y aplicada», sayfa 2

I. Examen microscópico bacteriano (morfología y tinciones)
Introducción

Los microorganismos se encuentran presentes en una amplia variedad de hábitats y sustratos (vegetales, animales, suelo, agua, etc.). Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, no se pueden ver a simple vista; solo es posible observarlos mediante un examen microscópico, el cual se realiza frotando la muestra biológica en una lámina portaobjeto y contrastándola con un colorante. Básicamente, se realizan dos tipos de exámenes microscópicos: el de microorganismos vivos y el de microorganismos muertos (Valenzuela, 2007). En esta práctica de laboratorio nos centraremos en el estudio de microorganismos muertos procedentes de cultivos bacterianos existentes en el laboratorio.

Examen microscópico de microorganismos muertos

Se realiza mediante la observación microscópica de preparaciones fijadas y teñidas, las cuales ofrecen tres ventajas principales para la observación: 1) aumentan el contraste entre la célula bacteriana y el medio que la rodea, 2) permiten distinguir diferentes tipos de células bacterianas según sea su capacidad de teñirse con cualquier colorante (como por ejemplo las tinciones de Gram y Ziehl-Neelsen), y 3) permiten establecer la morfología de la célula bacteriana y de otros microorganismos, su agrupación y también algunas estructuras específicas (Valencia, 2004). Este tipo de preparaciones se basa en los siguientes procedimientos: extensión, fijación y tinción.

•Extensión: consiste en depositar asépticamente, en el centro de un portaobjeto, una gota de agua destilada y, con ayuda del asa de siembra, extraer el inóculo desde un cultivo bacteriano. Luego con el asa estéril se procede a expandir el inóculo junto con la gota de agua sobre la superficie del portaobjeto de manera que quede uniformemente repartida.

•Fijación: después de extendidas, las células bacterianas se deben adherir al portaobjeto en el cual se van a teñir. Para el caso de las bacterias, la fijación por calor es lo más común (método físico a través de la llama del mechero), pero también se recurre a compuestos químicos como formaldehído, ácido fénico, alcoholes, etc. (método químico). En esta práctica utilizaremos el calor para matar las bacterias y adherirlas al portaobjeto.

•Tinción: una vez fijada la muestra, se procede a su tinción, para lo cual se hace uso de colorantes. La mayoría de ellos son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por componentes celulares. Muchos de los colorantes utilizados corresponden a moléculas cargadas positivamente (colorantes catiónicos) como azul de metileno, cristal violeta o safranina, y se combinan con gran afinidad con constituyentes celulares cargados negativamente, tales como ácidos nucleicos y polisacáridos. También existen colorantes aniónicos (moléculas cargadas negativamente), como la eosina, que se combinan con componentes celulares cargados positivamente como proteínas. Un tercer grupo de colorantes está formado por compuestos que se combinan con los materiales lipídicos de las células y son utilizados para localizar depósitos de grasa; por ejemplo, el colorante negro de Sudán (López-Jácome, et ál., 2014).

Existen sustancias químicas denominadas mordientes, que son capaces de combinarse con algún constituyente celular y alterarlo de tal forma que sea más vulnerable a un colorante, de manera que algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con esta sustancia. Los mordientes no son colorantes por sí mismos, y algunos ejemplos de estas sustancias son el ácido fénico y el ácido tánico (Arias y Gómez, 2001).

Mediante las tinciones especiales se pueden determinar morfología, agrupación, flagelos, endosporas, etc. Aun así, es preciso tener en cuenta que todos los métodos de tinción deberán usarse con precaución ya que pueden conducir a errores debido a que las moléculas de colorantes forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones artificiales inducidas por el propio colorante.

Tipos de tinciones

Según el número de colorantes utilizados, las tinciones se pueden agrupar en dos categorías: tinciones simples (en las cuales se emplea un solo colorante) y tinciones compuestas o diferenciales (en las que se emplea más de un colorante).

•Tinción simple: consiste en la aplicación de un solo colorante al extendido previamente fijado, con lo cual se aumenta el contraste de las células para poder observarlas claramente. Uno de los colorantes más indicados es el azul de metileno, que actúa rápida y suavemente sobre todas las células bacterianas y no oscurece los detalles celulares. Además, es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe (Gamazo, et ál., 2005). La tinción simple tiene como objetivo determinar la morfología y agrupación que presentan las bacterias (figura 1).

•Tinciones compuestas o diferenciales: son aquellas en la que se emplea más de un tipo de colorante, por lo que todas las células de la muestra no quedan teñidas iguales. Esto permite poner en evidencia, aparte de la morfología de los microorganismos y su agrupación, algunas estructuras como endosporas, flagelos, depósitos de grasas y la reacción de las bacterias frente a un colorante específico. En esta guía de práctica se realizarán las tinciones diferenciales de Gram, Writz y Ziehl-Neelsen:

•Tinción de Gram: el organelo responsable de la tinción de Gram es la pared celular. La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro según la tinción introducida por Christian Gram (1884) es una característica taxonómica importante con la que se correlacionan también otras propiedades de las bacterias. Este procedimiento se inicia con una tinción de las células bacterianas fijadas mediante el colorante básico cristal violeta. A continuación se trata con una solución de yodo (lugol), el cual forma una laca con el cristal violeta, que es insoluble en agua y solo medianamente soluble en alcohol o acetona. Las células se tratan después con alcohol acetona, de modo que las células Gram positivas retienen el complejo colorante-yodo y quedan azules, y las células Gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona. Estas últimas se hacen visibles mediante una coloración de contraste con otro colorante como la fucsina o safranina (Schlegel, 1997). La tinción de Gram tiene como objetivo identificar la morfología de las células bacterianas, su agrupación y la reacción al Gram (Gram positiva o Gram negativa).

•Tinción de Wirtz: esta tinción permite colocar en evidencia las endosporas bacterianas, cuyos constituyentes químicos son capaces de retener fuertemente el colorante verde de malaquita al 7,6%, adquiriendo el color de éste, mientras que el resto de la célula bacteriana se tiñe del color del colorante de contraste utilizado. La tinción de Wirtz tiene como objetivo determinar la presencia de las endosporas, aparte de observar la morfología de la célula y su agrupación.

•Tinción de Ziehl-Neelsen (ZN): esta tinción fue instituida por el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen. Principalmente se emplea para aquellas bacterias difíciles de teñir como las del género Mycobacterium también conocidas como bacterias ácido-alcohol resistentes (AAR). En esencia son bacterias Gram positivas, pero no retienen el colorante cristal violeta debido a que tienen una pared muy gruesa hidrofóbica, cerosa y rica en ácidos micólicos, lo cual les confiere resistencia a muchos colorantes. La tinción utiliza el colorante fucsina fenicada (colorante primario), el cual debe aplicarse en condiciones de calor, pero sin dejar secarlo con el fin de que penetre la pared celular de las bacterias. Posteriormente, se aplica una mezcla de ácido y alcohol (decolorante), y por último, el colorante de contraste (azul de metileno). Las células ácido-alcohol resistentes permanecen teñidas de fucsia ya que retienen el primer colorante, mientras que las no resistentes se decoloran con el ácido-alcohol y se teñirán de azul con el colorante de contraste (Gamazo, et ál., 2005). La tinción NZ tiene como objetivo determinar la resistencia al alcohol ácido, aparte de la morfología y agrupación de las células bacterianas.

Figura 1. Morfología y agrupación de las células bacterianas.

Objetivo

El estudiante deberá, a partir de cada una de las tinciones que realice, determinar la morfología de las células bacterianas y su agrupación y observar endosporas. Así mismo estará en capacidad de identificar la reacción a la tinción de Gram y Ziehl-Neelsen.

Materiales

•Cultivo de Escherichia coli.

•Cultivo de Klebsiella pneumoniae.

•Cultivo de Staphylococcus aureus.

•Cultivo de Bacillus cereus.

•Cultivo de Mycobacterium sp.

•Láminas portaobjetos.

•Asas de siembra.

•Solución de azul de metileno.

•Solución de violeta de genciana.

•Solución cristal violeta.

•Lugol.

•Alcohol acetona.

•Solución de fucsina.

•Solución de safranina al 0,25%.

•Solución de verde de malaquita al 7,6%.

•Solución de fucsina fenicada.

•Ácido-alcohol.

•Rejillas para tinción.

•Bandejas.

•Frascos lavadores con agua.

•Toallas de papel absorbente.

•Aceite de inmersión.

•Microscopios.

•Mecheros.

•Fósforos.

Procedimiento
Preparación del frotis bacteriano (figura 2)

—Tome varios portaobjetos y, con ayuda de un marcador permanente de punta fina, trace pequeños espacios, los cuales serán utilizados para el rotulado de las preparaciones microscópicas.

—Deposite 1 ó 2 gotas de agua destilada en los espacios delimitados para los extendidos de los inóculos.

—Con ayuda del asa de siembra, previamente esterilizada en la llama del mechero, extraiga asépticamente una porción de la colonia bacteriana que se encuentra en los cultivos (S. aureus, E. coli, B. cereus, Mycobacterium tuberculosis) y deposítela en el centro del portaobjeto junto con las gotas de agua destilada.

—Extienda la porción de la colonia con la gota de agua en el portaobjeto utilizando el asa de siembra. Realice círculos sucesivos en el portaobjeto hasta cubrir todo el espacio delimitado para el extendido.

—Fije el extendido. Para esto deberá pasarlo por la llama del mechero levemente.

—­Realice todos los frotis bacterianos para las diferentes tinciones.

Figura 2. Procedimientos para la obtención de un frotis bacteriano.

Tinción simple (figura 3)

—Tome los portaobjetos que contienen los frotis destinados para la tinción simple. Para este caso se recomienda trabajar con los frotis de las bacterias S. aureus y B. cereus.

—Deposite ahora los portaobjetos en la rejilla y proceda a teñirlos agregando sobre las muestras el colorante azul de metileno o violeta de genciana. Déjelos actuar por un minuto.

—Elimine el colorante y lave con agua. Seque con papel absorbente presionando suavemente los portaobjetos y luego exponiéndolos suavemente a la llama del mechero.

—Observe las preparaciones al microscopio, primero con los objetivos de menor aumento (10X, 40X), agregue una gota de aceite de inmersión y enfoque con el objetivo de inmersión (100X).

—Identifique la morfología y agrupación de las bacterias observadas y esquematícelas.

—Terminada la observación, elimine las preparaciones en la bandeja.

Figura 3. Procedimientos básicos para la tinción simple.

Tinción de Gram (figura 4)

—Tome los portaobjetos que contienen los frotis destinados para la tinción de Gram. Para este caso se recomienda trabajar con los frotis de las bacterias E. coli, S. aureus y B. cereus.

—Deposite ahora los portaobjetos con su muestra fijada sobre la rejilla.

—Tiña con cristal violeta durante un minuto.

—Elimine el colorante y lave suavemente con agua.

—Aplique lugol (mordiente) durante un minuto.

—Elimine el lugol y lave con agua.

—Decolore con una solución de alcohol-acetona durante 10-30 segundos (el tiempo dependerá del grosor del frotis).

—Elimine el alcohol-acetona y lave con agua.

—Tiña con fucsina o safranina (contraste) por un minuto.

—Elimine el colorante de contraste y lave con agua.

—Seque con papel absorbente presionando suavemente los portaobjetos y luego expóngalos de forma muy suave a la llama del mechero.

—Observe las preparaciones al microscopio, primero con los objetivos de menor aumento (10X, 40X) y busque la zona donde depositó la muestra. Una vez logrado esto, enfoque con el objetivo de inmersión (100X) tal como lo hizo en la tinción simple.

—Termine la observación identificando la morfología, la agrupación y la reacción al Gram de las bacterias observadas y esquematícelas.

—Elimine las preparaciones en la bandeja.

Figura 4. Pasos de la tinción de Gram.

Tinción de Wirtz (figura 5)

—Tome el portaobjeto que contiene el frotis para la tinción de Wirtz. Para este caso se trabajará con el extendido de la bacteria B. cereus.

—Deposite ahora el portaobjeto con su muestra fijada sobre la rejilla.

—Tiña de 6 a 8 minutos con verde de malaquita al 7,6% con calor del mechero y sin dejar secar el colorante.

—Elimine el colorante y lave con agua por 10 a 15 segundos.

—Tiña con una solución al 0,25% de safranina por quince segundos.

—Elimine la safranina y lave con agua.

—Seque con papel absorbente presionando suavemente el portaobjeto y luego expóngalo de forma muy suave a la llama del mechero.

—Observe con el objetivo de inmersión (100X) como de costumbre.

—Identifique las esporas bacterianas de manera libre (exosporas) o en su defecto las endosporas. Esquematice lo observado.

—Terminada la observación, elimine la preparación en la bandeja.

Figura 5. Procedimientos de la tinción de Wirtz.

Tinción de Ziehl-Neelsen (figura 6)

—Tome el portaobjeto que contiene el frotis para la tinción de Zielh-Neelsen. Para este caso se trabajará con el extendido de la bacteria M. tuberculosis.

—Deposite ahora el portaobjeto con su muestra fijada sobre la rejilla.

—Cubra la preparación con fucsina fenicada y deje actuar por cinco minutos con calor del mechero hasta desprender vapores, pero sin dejar secar el colorante.

—Elimine el colorante y lave con agua de 10 a 15 segundos.

—Decolore con alcohol ácido durante 10-20 segundos.

—Elimine el alcohol ácido y lave con agua.

—Tiña con azul de metileno como colorante de contraste durante 2 minutos.

—Elimine el colorante y lave con agua de 10 a 15 segundos.

—Seque con papel absorbente presionando suavemente el portaobjeto y luego expóngalo de forma muy suave a la llama del mechero.

—Observe con el objetivo de inmersión (100X) como de costumbre.

—Identifique las células bacterianas AAR teñidas de color fucsia y esquematícelas.

—Terminada la observación, elimine su preparación en la bandeja.

Figura 6. Pasos de la tinción de Zielh-Neelsen.

Complete las siguientes tablas de acuerdo con las tinciones realizadas:

Preguntas complementarias

1.¿Cuáles son los dos propósitos de la fijación por calor?

A.

B.

2.¿Por qué los colorantes básicos son más apropiados para teñir bacterias que los colorantes ácidos?

3.¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram?

4.¿Qué son bacterias Gram variables? Cite tres ejemplos.

II. Medios de cultivos
Introducción

En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas muy variadas y diferentes. La Microbiología se ha podido desarrollar debido a la posibilidad de estudiar especies aisladas de microorganismos, gracias a la aplicación de los medios de cultivos.

Existen y se utilizan una gran variedad de medios de cultivos cuya composición varía de acuerdo con las necesidades nutricionales de los organismos que se pretende estudiar. Así, el trabajo de aislamiento en cultivo puro de una especie dada puede facilitarse con ayuda de medios de cultivos que aprovechan alguna característica particular para sus exigencias nutricionales, aparte de considerar otros requerimientos como la temperatura, el oxígeno, el pH, etc. (Gómez y Batista, 2006).

Los medios de cultivos se definen como cualquier preparado, sólido o líquido, que contiene todas las sustancias nutritivas para el desarrollo de los microorganismos. Este debe ser estéril, tener un pH adecuado y estar protegido de la contaminación ambiental (Valenzuela, 2007).

En general, todo medio de cultivo debe contener los siguientes grupos de nutrientes:

•Fuente de hidrógeno: constituye la fuente de energía. Generalmente, es un azúcar que funciona a la vez como carbono.

•Aceptores de hidrógeno: son indispensables para aquellos microorganismos que no ocupan el oxígeno en la respiración y para aquellos microorganismos fermentadores que no utilizan sus propios metabolitos como aceptor de hidrógenos.

•Fuente de carbono: todos los microorganismos necesitan una fuente de carbono; algunos utilizan el CO2 del aire (autótrofos), pero la mayoría de las bacterias utiliza compuestos orgánicos carbonados preformados (organótrofos).

•Fuente de nitrógeno: es esencial para todos los organismos. Algunos lo requieren como compuesto orgánico, y otros pueden utilizar compuestos inorgánicos. Un pequeño grupo puede utilizar el nitrógeno atmosférico; por ejemplo, Azotobacter.

•Sales minerales: aportan elementos tales como azufre, fósforo y algunos activadores enzimáticos presentes en las coenzimas de los citocromos y en las peroxidasas (oligoelementos: Ca2+, Mg2+, Fe2+, Co2+, Mn2+, Cu2+, etc.). Todos los microorganismos necesitan aporte de sales minerales para su desarrollo.

•Factores de crecimientos: un factor de crecimiento es un compuesto orgánico (aminoácidos y bases nitrogenadas) que una célula debe tener para su crecimiento pero que ella misma no es capaz de sintetizar.

Clasificación de los medios de cultivos

Los medios de cultivos se han clasificado en forma artificial de acuerdo con su estado físico, composición química y utilización, solo para fines de ordenamientos.

Según su estado físico, los medios se clasifican en:

•Medios líquidos: comúnmente llamados caldos. Se emplean para la homogenización de muestras, realizar diluciones y enriquecimiento del medio de cultivo. Así mismo, son útiles para la activación de cepas microbianas liofilizadas. Por lo general, estos medios suelen servirse en tubos de ensayos o en matraces cuando se requiere analizar grandes cantidades de muestras (figura 7). Ejemplos: caldo peptona, caldo infusión cerebro corazón, caldo lactosado, caldo brila, etcétera.

Figura 7. Medios de cultivos líquidos. a)Caldo lactosado, b) Caldo brila, c) Caldo Salmosyst.

•Medios sólidos: se conocen como agares. Se obtienen a partir de medios de cultivos líquidos a los cuales se les agrega una sustancia solidificante, como por ejemplo agar-agar, gelatina o gel de sílice (los agares no deben confundirse con el agar-agar; este último es solo un agente solidificante y no brinda condiciones nutricionales). Los agares son empleados frecuentemente en placas de Petri o en tubos de ensayos de manera inclinada (figura 8), y son útiles para el aislamiento de microorganismos a través del desarrollo de colonias y mantenimiento de cultivos puros. Ejemplo: agar peptona, agar SPC, agar EMB, agar SS, agar sal manitol rojo de fenol, etcétera.

Figura 8. Medios de cultivos sólidos. a) Agar SS, b) Agar Baird Parker, c) Agar sangre, d) Agares LIA, TSI y citrato en forma inclinada.

•Medios semisólidos: tienen una consistencia sólida leve o gelatinosa. Provienen de medios de cultivos líquidos a los cuales se les ha adicionado una pequeña cantidad de agar-agar (0,4-0,8%). Por lo general, se usan tubos de ensayo y se emplean para determinar la movilidad de bacterias (figura 9). Ejemplo: agar SIM, agar MIO, etcétera.

Figura 9. Medios de cultivos semisólidos agar SIM. a) Observación de crecimiento bacteriano en todo el medio (móvil), b) Observación de crecimiento bacteriano solo en la línea de inoculación (inmóvil).

Fuente: Benadof (2008).

Según la composición química, los medios se clasifican en:

•Medios sintéticos o artificiales: se preparan a partir de ingredientes químicamente definidos, conociéndose exactamente su calidad y cantidad, y se utilizan en estudios de metabolismo. Ejemplo: agar nutritivo, agar TCBS, agar XLD, etcétera.

•Medios naturales: se desconoce su composición exacta. Se preparan a partir de hidrolizados, extractos de células o tejidos (ejemplo: extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc.). Son de uso común en los laboratorios de rutina y también se pueden adquirir como productos comerciales, deshidratados, elaborados por laboratorios. Ejemplo: agar peptona, agar sangre, agar papa dextrosa, agar zanahoria, etcétera.

Según la utilización, los medios se clasifican en:

•Medios comunes o básicos: son aquellos en los cuales crecen gran número de especies bacterianas poco exigentes nutricionalmente. Ejemplo: caldo común, agar peptona.

•Medios enriquecidos: son medios de cultivos comunes a los que se les agregan ciertos ingredientes que enriquecen su condición nutritiva original. Se emplean para el aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes o injuriados. Ejemplo: agar sangre, que está constituido de agar peptona más 5% de sangre desfibrinada; el caldo glucosado, que es caldo de peptona enriquecido con 1% de glucosa.

•Medios selectivos: son aquellos medios que han sido formulados químicamente de tal forma que favorecen el crecimiento de la especie que se desea aislar y al mismo tiempo suprimen el de cualquier otra especie competidora. Se preparan incluyendo generalmente algunas sustancias inhibidoras como antibióticos, sales biliares, etc. Ejemplos: agar SS, agar EMB (que al mismo tiempo son medios diferenciales).

•Medios diferenciales: son aquellos que favorecen el aislamiento de una especie dada a partir de un cultivo mixto, permitiendo reconocerla o detectarla a través de una característica bioquímica de valor taxonómico que le es propia: por ejemplo, la hemólisis de glóbulos rojos (en agar sangre), la coagulación del plasma, la fermentación de azúcares a través de cambios de pH que se detectan en el medio (que contienen un indicador de pH adecuado, como azul de bromotimol, rojo fenol, etcétera).

Las entidades comerciales de medios de cultivos como Merck, Oxoid, BBL, Difco, Scharlau, 3M, entre otras, han logrado desarrollar una variedad de medios de cultivos, facilitando el estudio de los microorganismos cultivables desde sus características nutricionales, fisiológicas, bioquímicas, serológicas y moleculares.